Um Gram-negativo bactéria, identificados como Pseudomonas aeruginosa AL98, é um potente degrader de borracha natural e sintética cis-1,4-poliisopreno

Resumo

Um Gram-negativo bactéria, tensão AL98, foi isolado da falta de água dentro de um deteriorado pneu de carro no campo da fazenda, em Münster, Alemanha., A estirpe foi capaz de desintegrar consideravelmente a borracha natural (NR), quer no estado bruto como concentrado de látex NR, quer no estado vulcanizado como luva de látex NR, bem como cis-1,4-poliisopreno sintético bruto (IR). Determinação da evolução do dióxido de carbono e número de células vivas durante o cultivo em lote com cada um dos materiais como única fonte de carbono, revelou mineralização do polímero de borracha durante o aumento da biomassa., A investigação da superfície através de microscopia eletrônica por varredura evidenciou um comportamento de crescimento adesivo da estirpe procedendo colonizando a superfície de borracha, fundindo-se na borracha e formando um biofilme antes da desintegração do material. A coloração do reagente de Schiff realizada com luvas de látex NR indicou a produção e acumulação de grupos aldeídos durante a colonização. O substrato de luva sólida desapareceu completamente após um período de cultivo prolongado como resultado da degradação contínua., As análises taxonómicas da estirpe, que também se basearam no exame de similaridade do gene rRNA completo 16S, revelaram a classificação da estirpe AL98 como uma estirpe de Pseudomonas aeruginosa. Este é o primeiro relatório sobre o isolamento de uma bactéria Gram-negativa que exibe fortes propriedades de decomposição da borracha.a borracha natural em bruto (NR) para aplicações técnicas é obtida como látex da árvore de borracha Hevea brasiliensis. Mais de 90% do peso seco do látex consiste em cis-1,4-poliisopreno (IR) (Mw >106 da)., Antes da sua conversão em produtos de borracha, é submetida a um novo processamento, como a concentração, mastigação e vulcanização, ou seja, a reticulação das cadeias de polímeros. IR também pode ser sintetizado quimicamente melhorando, mas não substituindo, todas as propriedades do produto natural. Sabe-se que ambos os tipos de borrachas de poliisopreno são suscetíveis à ação microbiana . A maioria das bactérias degradantes NR foram identificadas como membros do grupo de actinomycetes . Existe apenas um relatório sobre o tratamento do látex NR com o extrato bruto extracelular de uma bactéria Gram-negativa, uma Xanthomonas sp.,, levando à formação de oligômeros com Mw entre 103 e 104 Da . No entanto, a capacidade desta estirpe para colonizar e decompor borracha sólida foi bastante pobre .nesta comunicação, é relatado o isolamento da estirpe AL98 de degradação da borracha, que foi identificada como representativa da espécie Pseudomonas aeruginosa, indicando que não só actinomycetes são degradores potentes da NR e da IR., Uma vez que os membros desta espécie Gram-negativa são fisiologicamente e geneticamente bem caracterizados, esta estirpe pode oferecer vantagens para a elucidação das causas fisiológicas e genéticas da degradação da borracha.

2 Materiais e métodos

2.1 Borrachas

NR látex concentrado (Neotex Latz) foi obtida a partir de Weber e Schaer (Hamburgo, Alemanha) e IV (SKI3) da Continental AG (Hannover, Alemanha). As luvas de látex NR (rotiprotect™) foram compradas à Roth (Karlsruhe, Alemanha).

2.,2 culturas

culturas líquidas foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 300 ml contendo um meio de sais minerais (MSM), como descrito anteriormente . O concentrado de látex NR foi adicionado a 0,8% (v/v) a 30 ml de MSM, o que corresponde a 0,5% de matéria seca (w/v), tendo em conta as especificações do Fornecedor. As luvas de látex NR foram cortadas em pequenos pedaços de 0, 15 g, tendo cada uma sido adicionada sem tratamento adicional a 30 ml de MSM. O IR foi cortado em pequenos pedaços de cerca de 2-3 mm de diâmetro, extraído com acetona (1-2 dias), e 0,15 g foram adicionados a 30 ml de MSM., A esterilização por calor antes da inoculação foi feita em autoclave.

para microscopia electrónica de varrimento (SEM), as culturas de IR foram preparadas da seguinte forma: 3 g de borracha de IR extraída com acetona foram dissolvidas em 100 ml de clorofórmio para dar uma solução de IR a 3%. Pedaços retangulares finos de alumínio com uma superfície de cerca de 1 cm2 foram mergulhados nesta solução e secos em um fluxo de ar. Este procedimento foi repetido até que ambos os lados das peças de alumínio foram revestidos completamente com material de IR., As peças revestidas foram esterilizadas com etanol a 96% e adicionadas a 30 ml de solução MSM já autoclavada em frascos de 300 ml. As células foram pré-cultivadas durante a noite a 30 ° C em 10 ml de complexo Luria-Bertani (LB), lavadas duas vezes com solução salina, ressuspendidas em 1 ml de solução salina, e 10 µl foram inoculadas para as culturas contendo borracha. Os frascos inoculados foram incubados a 30 ° C e agitados a 180 rpm.foram realizadas culturas sólidas em placas de Petri contendo ágar LB ou ágar de látex MSM., Deste modo, foram utilizados dois tipos de placas de ágar de látex: (1) placas de película de látex, preparadas espalhando o concentrado de látex como uma película fina directamente sobre a ágar MSM, e (2) placas de sobreposição de látex, preparadas vertendo uma camada fina de ágar MSM contendo concentrado de látex disperso a uma concentração de 0,02% (m/v) Acima da ágar MSM sem fonte de carbono. A incubação das placas inoculadas foi efectuada a 30 ° C.,o padrão de Utilização do substrato foi realizado utilizando o sistema de identificação bacteriana BBL Oxi/Ferm Tube II (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, EUA), conforme especificado pelos fabricantes.

2.3 mineralização

A Medição da mineralização foi realizada em frascos hermeticamente fechados de 500 ml de Erlenmeyer, determinando a libertação de CO2 após diferentes períodos de cultivo, como descrito recentemente . A quantidade de substrato de borracha fornecida compreendia, em todos os casos, 0,25 g em 50 ml de MCM.

2.,4 coloração com reagente de Schiff

coloração de luvas de látex NR com reagente de Schiff foi recentemente mostrado . O procedimento análogo aplicado aqui foi o seguinte: em um frasco firmemente fechado, 10 ml do reagente fuchsin foi adicionado a uma amostra, e a cor púrpura foi desenvolvida para 10-30 minutos à temperatura ambiente. A quantidade excessiva de reagente foi então descartada, e 10 ml da solução de sulfito foram adicionados a fim de suprimir a reação de cor não específica da amostra em branco., A composição da fucsina reagente foi o seguinte: 2 g de fucsina dissolvido em 50 ml de ácido acético glacial, acrescido de 10 g Na2S2O5 mais 100 ml de 0,1 N HCl mais 50 ml de H2O. A composição da solução de sulfito de era: 5 g Na2S2O5 mais 5 ml de HCl concentrado (37-38%), ad 100 ml com H2O.

2.5 microscopia eletrônica de Varredura

NR-luvas de látex e IR revestido de finas peças de alumínio foram tiradas a partir de líquidos culturas em diferentes períodos de cultivo, fixados com glutaraldeído a 2,5% em 0,1 M de tampão fosfato (PBS; pH 7,3), de acordo com Sørensen ., Após lavagem com PBS, as culturas foram postfixadas em 1% de tetroxida de ósmio em 0,1 M PBS (pH 7.3) e desidratadas em etanol graduado(30%, 50%, 70%, 90%, 96% e etanol absoluto). As amostras desidratadas foram submetidas à secagem do ponto crítico com CO2 líquido de acordo com o procedimento padrão. Subsequentemente, as amostras foram montadas em cubos de amostras de alumínio utilizando carbono eletricamente condutor (PLANO, Wetzlar, Alemanha) e revestidas com cerca de 15 nm de ouro usando gás argônio como plasma ionizante. A imagem foi realizada com um microscópio eletrônico de varredura S-450 (SEM; Hitachi Ltd.,, Japão) com elétrons secundários a 20 kV voltagem de aceleração e à temperatura ambiente. Os micrografos foram gravados a partir de um tubo catódico de alta resolução usando filme negativo (Agfapan, APX 100).

2, 6 a análise de 16S ADNR

a extracção do ADN genómico foi efectuada como descrito anteriormente . A amplificação do gene rRNA 16S foi realizada usando oligonucleotídeos como primers, como descrito em . As sequências de nucleótidos do produto de PCR purificado foram determinadas com um sequenciador de ADN de 4000L (LI-COR Inc.,, Biotechnology Division, London, NE, USA) and a termo Sequenase-referred primer cycle-sequencing kit (Amersham Life Science, Little Chalfont, UK) as specified by the manufacturers employing the primers described in . As sequências de rDNA 16S foram alinhadas manualmente com sequências publicadas de representantes de pseudomonads obtidos do EMBL.

3 resultados

3.,1 isolamento da estirpe AL98

amostras ambientais de água suja no interior de pneus deteriorados de automóveis no campo de um agricultor em Münster, Alemanha, foram recolhidas e subsequentemente rastreadas para detectar a ocorrência de bactérias de degradação da borracha. O isolamento de dois actinomycetes novos pertencentes ao género Gordonia (Ex-Gordona), após enriquecimento em material para pneus granulares, foi anteriormente referido ., Uma das amostras foi enriquecida com concentrado de látex NR em cultura líquida que mostrou um aumento substancial na turvação e uma considerável desintegração do material de látex sólido que foi inicialmente coagulado completamente para uma amêijoa nas condições de cultivo escolhidas (agitação a 180 rpm em MSM). Esta cultura de enriquecimento foi posteriormente testada para o crescimento em placas de película de látex. A incubação nocturna revelou áreas verdes no filme de látex., Um enriquecimento adicional destas áreas em placas de LB revelou colónias únicas de um isolado bacteriano, designado como estirpe AL98, que formaram colónias esverdeadas em placas de LB após 1 dia e também levaram a uma coloração esverdeada escura do ágar de LB após 2 dias. O crescimento em placas de película de látex ocorreu como um biofilme sem formação de colônias clássicas causando coloração esverdeada de ambos, o material de látex que estava em contato direto com as células e também o msm agar., Esta cor esverdeada transformou-se numa cor ligeiramente avermelhada durante uma incubação prolongada (>1 semana); isto foi acompanhado por uma limpeza do filme de látex na área do biofilme. Não foi possível determinar o crescimento da estirpe em placas sobrepostas de látex.

3. 2 a classificação taxonómica

estirpe AL98 foi uma bactéria em forma de vara, gram-negativa, oxidase-positiva e catalase-positiva (0, 5 µm por 2 a 3 µm). Devido a estas características, foi realizada uma análise de identificação pelo sistema BBL Oxi/Ferm Tube II., Posteriormente, o padrão de Utilização do substrato revelou os seguintes resultados: crescimento da arginina, N2, xilose, glucose (aeróbica), ureia e citrato; ausência de crescimento da glucose (anaeróbica), lactose, sacarose, indole, maltose, manitol e fenilalanina; reacção indistinta para a lisina. O código de número obtido resultou numa classificação A P. aeruginosa, independentemente do resultado da reacção da lisina.a caracterização taxonómica adicional da estirpe AL98 foi efectuada por análise do gene rRNA 16S. O gene quase completo foi sequenciado consistindo de 1530 nucleótidos., De acordo com os resultados da pesquisa da base de dados EMBL, a sequência revelou semelhanças mais elevadas que variam de 99,9% a 100% a várias estirpes de P. aeruginosa listadas. As semelhanças mais elevadas seguintes foram 98,7% com Pseudomonas resinovorans e 97,7% com Pseudomonas alcaligenes. De acordo com Moore et al. As estirpes de P. aeruginosa possuem uma região de 32-bp em seu rDNA 16S, correspondendo às posições de E. coli 66-103, que é hipervariável entre diferentes espécies do gênero Pseudomonas, mas 100% conservada entre as estirpes de P. aeruginosa. Exactamente a mesma sequência, que é típica de P., aeruginosa, também foi determinada para a estirpe AL98 nas posições 58-89. Os dados de sequência genética 16S rRNA foram submetidos à base de dados de sequência de nucleótidos EMBL e estão listados no número de adesão. AJ249451. A estirpe AL98 foi depositada na colecção de culturas do Institut für Mikrobiologie, Münster, Alemanha, como P. aeruginosa AL98.3. 3 desintegração da borracha natural culturas puras de P. aeruginosa AL98 foram obtidas a partir de placas LB após várias passagens neste meio e testadas para crescimento em concentrado de látex NR., A desintegração visível da borracha coagulada começou apenas após 2 a 3 semanas de incubação. Em contraste, quando as células AL98 de culturas de látex foram usadas como inóculo, a desintegração do material já começou após 2 dias. Se estas “células adaptadas” foram subsequentemente submetidas a várias passagens em placas de LB, novamente foi observado um início atrasado do processo de desintegração da borracha. Foi geralmente observado que o crescimento foi ainda mais atrasado quanto mais passagens no meio LB foram realizadas. Observação Simultânea por microscopia de luz revelada em qualquer caso apenas um tipo de varas móveis., No entanto, as células lavadas de culturas adaptadas tendiam geralmente a adsorver nas paredes das chávenas Eppendorf ou dos tubos de vidro utilizados para lavagem em contraste com as células de culturas de LB, que eram microscopicamente idênticas às células de cultura de látex, mas não apresentavam quaisquer propriedades adesivas. Testes de crescimento realizados com várias outras estirpes de P. aeruginosa de diferentes coleções de culturas, tais como PAO1, DSM 50071, DSM 939 e ATCC 27853, não revelaram nenhum crescimento na borracha natural e exibiram mesmo uma diminuição no número de células vivas durante a incubação em meios contendo borracha (dados não mostrados).

3.,4 Crescimento no cis-1,4-poliisopreno

Vários IV contendo materiais foram utilizados exclusivamente como fontes de carbono para determinar a capacidade e a extensão do crescimento de P. aeruginosa AL98 em borrachas: NR-látex concentrado, que contém >90% do peso seco de IR, NR luvas de látex, o que corresponde a vulcanizada NR, i.e. com cruzadas entre as cadeias poliméricas, bem como matérias sintéticas IR. Em todos os casos, o crescimento foi determinado com células adaptadas. Figo. 1A refere-se ao tempo de mineralização dos substratos de borracha., Para a avaliação da liberação de CO2, foi assumido que as borrachas empregadas consistiam totalmente de carbono. Após 6 semanas, foi detectada a melhor mineralização com concentrado de látex NR (36%), seguida de luvas de látex NR (26%) e IR (21%). Além disso, também foram detectados aumentos da biomassa das mesmas culturas para os três substratos, como mostrado na Fig. 1B mostrando o curso temporal da contagem de células vivas durante a incubação nestes substratos., Apesar do comportamento de crescimento preferencialmente adesivo, ocorreu um aumento no número de células suspensas no meio durante o cultivo com concentrado de látex NR (35 vezes), Luva de látex NR (11 vezes), bem como IR (sete vezes).cultivo de P. aeruginosa AL98 na IR contendo borrachas no concentrado de látex ( ● ), Luva de látex NR ( ○ ) e IR (▾). R: tempo de mineralização expresso em % de CO2 libertado do carbono total. B: aumento do número de células vivas em suspensão durante o cultivo. Os valores são meios de medições triplas.,

3, 5 SEM e outras análises de superfícies de borracha

o comportamento de colonização e a formação de biofilm de P. aeruginosa AL98 no material das luvas de látex NR foram investigados por SEM (Fig. 2)., Em comparação com um controlo não inoculado (Fig. 2A), A superfície de borracha foi completamente coberta por um biofilme após um período de cultivo de 6 semanas (Fig. 2B). Figo. 2C mostra células que se fundem no material de borracha, o que ocorreu após 2 semanas, enquanto após 6 semanas de incubação a desintegração adicional do material tornou-se visível (Fig. 2D).micrografos de electrões secundários que mostram crescimento de P. aeruginosa AL98 em luvas de látex NR. A: controlo não inoculado que mostre a superfície de borracha. B: biofilme formado na superfície de borracha após 6 semanas. C: Detalhes do crescimento após 2 semanas., D: detalhes do crescimento após 6 semanas. As barras correspondem a 5 µm.microfones secundários que mostram crescimento de P. aeruginosa AL98 em luvas de látex. A: controlo não inoculado que mostre a superfície de borracha. B: biofilme formado na superfície de borracha após 6 semanas. C: Detalhes do crescimento após 2 semanas. D: detalhes do crescimento após 6 semanas. As barras correspondem a 5 µm.

Biofilm formation was also demonstrated after 6 weeks by staining the overgrown latex gloves with Schiff’s reagent., A cor púrpura produzida pelo reagente forneceu evidências de que produtos de degradação contendo grupos aldeídos foram produzidos e acumulados durante a degradação microbiana, como foi recentemente relatado por Tsuchii .foi também observada desintegração completa do material das luvas após períodos de cultivo prolongados superiores a 3 meses., Os primeiros experimentos para otimizar este processo de desintegração resultaram em uma degradação muito acelerada das luvas, quando o MSM foi substituído de tempos em tempos por MSM fresco durante o cultivo de lotes líquidos, indicando que a cultura semi-contínua é uma estratégia possível para melhorar a taxa de degradação, Como anteriormente descoberto para uma estirpe de Nocardia de degradação da borracha .

O Crescimento de P. aeruginosa AL98 na IR é mostrado nos micrografos SEM do Fig. 3. A formação de biofilmes já era visível após uma semana de cultivo. Figo. 3B demonstra al98 varetas colonizando a superfície de borracha, e Fig., 3C mostra células se fundindo na borracha e os fortes contatos entre as células por meio de pilli. Finalmente, Fig. 3D ilustra uma região do biofilme formado após 4 semanas na superfície de IR.