une bactérie à Gram négatif, identifiée comme Pseudomonas aeruginosa AL98, est un puissant dégradateur du caoutchouc naturel et du cis-1,4-polyisoprène synthétique

résumé

une bactérie à Gram négatif, la souche AL98, a été isolée dans de l’eau nauséabonde à l’intérieur d’un wagon détérioré pneu sur le champ d’un agriculteur à Münster, en Allemagne., La souche a été capable de désintégrer considérablement le caoutchouc naturel (NR), soit à l’état brut sous forme de concentré de latex NR, soit à l’état vulcanisé sous forme de gant en latex NR, ainsi que le cis-1,4-polyisoprène synthétique brut (IR). La détermination de l’évolution du dioxyde de carbone et du nombre de cellules vivantes pendant la culture par lots avec chacun des matériaux comme seule source de carbone, a révélé une minéralisation du polymère de caoutchouc lors de l’augmentation de la biomasse., L’étude de la surface par microscopie électronique à balayage a permis de mettre en évidence un comportement de croissance adhésive de la souche en colonisant la surface du caoutchouc, en fusionnant dans le caoutchouc et en formant un biofilm avant la désintégration du matériau. La coloration du réactif de Schiff effectuée avec des gants en latex NR a indiqué la production et l’accumulation de groupes aldéhydes pendant la colonisation. Le substrat de gant solide a complètement disparu après une période de culture prolongée à la suite d’une dégradation continue., Les analyses taxonomiques de la souche, qui étaient également basées sur l’examen de similitude du gène complet de l’ARNr 16S, ont révélé la classification de la souche AL98 comme une souche de Pseudomonas aeruginosa. Il s’agit du premier rapport sur l’isolement d’une bactérie à Gram négatif présentant de fortes propriétés de décomposition du caoutchouc.

1 Introduction

Le caoutchouc naturel brut (NR) pour des applications techniques est obtenu sous forme de latex à partir de L’hévéa Hevea brasiliensis. Plus de 90% du poids sec du latex est constitué de cis-1,4-polyisoprène (IR) (Mw >106 Da)., Avant la conversion en produits en caoutchouc, il subit un traitement ultérieur, comme la concentration, la mastication et la vulcanisation, c’est-à-dire la réticulation des chaînes polymères. L’IR peut également être synthétisé chimiquement, améliorant ainsi, mais ne remplaçant pas, toutes les propriétés du produit naturel. Les deux types de caoutchoucs de polyisoprène sont connus pour être sensibles à l’action microbienne . La plupart des bactéries dégradantes de NR ont été identifiées comme membres du groupe des actinomycètes . Il n’y a qu’un seul rapport sur le traitement du latex NR avec l’extrait brut extracellulaire d’une bactérie à Gram négatif, un Xanthomonas sp.,, conduisant à la formation d’oligomères avec Mw entre 103 et 104 Da . Cependant, la capacité de cette souche à coloniser et à décomposer le caoutchouc solide était plutôt médiocre .

dans cette communication, l’isolement de la souche dégradante du caoutchouc AL98, qui a été identifiée comme représentative de L’espèce Pseudomonas aeruginosa, est rapporté, ce qui indique que non seulement les actinomycètes sont de puissants dégradateurs de NR et IR., Étant donné que les membres de cette espèce à Gram négatif sont physiologiquement et génétiquement bien caractérisés, cette souche peut offrir des avantages pour l’élucidation des causes physiologiques et génétiques de la dégradation du caoutchouc.

2 matériaux et méthodes

2.1 caoutchoucs

le concentré de latex NR (Neotex Latz) a été obtenu de Weber et Schaer (Hambourg, Allemagne) et IR (SKI3) de Continental AG (Hanovre, Allemagne). Les gants en latex NR (rotiprotect™) ont été achetés auprès de Roth (Karlsruhe, Allemagne).

2.,2 Cultures

des cultures liquides ont été réalisées dans des flacons Erlenmeyer de 300 ml contenant un milieu de sels minéraux (MSM), comme décrit précédemment . Le concentré de latex NR a été ajouté à 0,8% (v/v) à 30 ml DE MSM, ce qui correspond à 0,5% de matière sèche (p/v) compte tenu des spécifications du fournisseur. Les gants en latex NR ont été coupés en petits morceaux de 0,15 g, et chacun a été ajouté sans autre traitement à 30 ml DE MSM. IR a été coupé en petits morceaux d’environ 2-3 mm de diamètre, extrait avec de l’acétone (1-2 jours), et 0,15 g ont été ajoutés à 30 ml MSM., La stérilisation par la chaleur avant l’inoculation a été effectuée dans un autoclave.

pour la microscopie électronique à balayage (MEB), des cultures IR ont été préparées comme suit: 3 g de caoutchouc IR extrait d’acétone ont été dissous dans 100 ml de chloroforme pour donner une solution IR à 3%. De minces morceaux rectangulaires d’aluminium d’une surface d’environ 1 cm2 ont été trempés dans cette solution et séchés dans un courant d’air. Cette procédure a été répétée jusqu’à ce que les deux côtés des pièces en aluminium soient complètement recouverts d’un matériau IR., Les pièces enduites ont été stérilisées avec de l’éthanol à 96% et ajoutées à 30 ml de solution MSM déjà autoclavée dans des flacons de 300 ml. Les cellules ont été précultivées pendant la nuit à 30°C dans 10 ml de milieu complexe Luria-Bertani (LB), lavées deux fois avec une solution saline, remises en suspension dans 1 ml de solution saline et 10 µl ont été inoculés aux cultures contenant du caoutchouc. Les flacons inoculés ont été incubés à 30°C et agités à 180 tr / min.

des cultures solides ont été réalisées dans des boîtes de Pétri contenant soit de la gélose LB, soit de la gélose latex MSM., Ainsi, deux types de plaques de gélose au latex ont été utilisés: (1) des plaques de film de latex, préparées en étalant le concentré de latex sous forme de film mince directement sur la gélose MSM, et (2) des plaques de superposition de latex, préparées en versant une fine couche de gélose MSM contenant du concentré de latex NR dispersé à une concentration de 0,02% (P/v) au-dessus de la gélose MSM ne contenant aucune source de carbone. L’Incubation des plaques inoculées s’est faite à 30°C.,

le modèle D’utilisation du substrat a été réalisé en utilisant le système d’identification bactérienne BBL Oxi/Ferm Tube II (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA) tel que spécifié par les fabricants.

2.3 minéralisation

La mesure de la minéralisation a été effectuée dans des flacons Erlenmeyer hermétiques de 500 ml en déterminant le rejet de CO2 après différentes périodes de culture, comme décrit récemment . La quantité de substrat en caoutchouc fournie comprenait dans tous les cas 0,25 g dans 50 ml MSM.

2.,4 coloration avec le réactif de Schiff

La coloration de gants en latex NR avec le réactif de Schiff a été récemment montrée . La procédure analogue appliquée ici était la suivante: dans une bouteille hermétiquement bouchée, 10 ml du réactif de fuchsine ont été ajoutés à un échantillon et la couleur pourpre a été développée pendant 10-30 min à température ambiante. La quantité excédentaire du réactif a ensuite été rejetée et 10 ml de la solution de sulfite ont été ajoutés afin de supprimer la réaction de couleur non spécifique de l’échantillon à blanc., La composition du réactif de fuchsine était la suivante: 2 g de fuchsine dissous dans 50 ml d’acide acétique glacial plus 10 g de Na2S2O5 plus 100 ml de HCl 0,1 N plus 50 ml de H2O. la composition de la solution de sulfite était: 5 g de Na2S2O5 plus 5 ml de HCl concentré selon Sørensen, des gants et de minces morceaux d’aluminium revêtus d’ir ont été prélevés dans des cultures liquides à différentes périodes de culture, fixés avec 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate de 0,1 M (PBS; pH 7,3)., Après lavage avec du PBS, les cultures ont été postfixées dans du tétroxyde d’osmium à 1% dans 0,1 M de PBS (pH 7,3) et déshydratées dans de l’éthanol gradué(30%, 50%, 70%, 90%, 96% et éthanol absolu). Les échantillons déshydratés ont été soumis au séchage au point critique avec du CO2 liquide selon la procédure standard. Par la suite, les échantillons ont été montés sur des souches d’échantillons en aluminium à l’aide de carbone électriquement conducteur (PLANO, Wetzlar, Allemagne) et recouverts d’or à environ 15 nm à l’aide de gaz argon comme plasma ionisant. L’imagerie a été réalisée avec un microscope électronique à balayage S-450( SEM; Hitachi Ltd.,, Japon) avec des électrons secondaires à une tension d’accélération de 20 kV et à température ambiante. Des micrographies ont été enregistrées à partir d’un tube cathodique à haute résolution utilisant un film négatif (Agfapan, APX 100).

2.6 analyse de l’ADNR 16S

L’extraction de L’ADN génomique a été effectuée comme décrit précédemment . L’Amplification du gène de l’ARNr 16S a été réalisée en utilisant des oligonucléotides comme amorces comme décrit dans . Les séquences nucléotidiques du produit PCR purifié ont été déterminées à l’aide d’un séquenceur D’ADN 4000L (LI-COR Inc.,, Biotechnology Division, London, NE, États-Unis) et un kit de séquençage du cycle d’amorces marquées par fluorescence Thermo-Séquenase (Amersham Life Science, Little Chalfont, Royaume-Uni) tel que spécifié par les fabricants utilisant les amorces décrites dans . Les séquences d’ADNR 16S ont été alignées manuellement avec les séquences publiées à partir de représentants de pseudomonades obtenues à partir D’EMBL.

3 Résultats

3.,1 isolement de la souche AL98

des échantillons environnementaux provenant d’eau nauséabonde à l’intérieur de pneus de voiture détériorés dans un champ d’un agriculteur à Münster, en Allemagne, ont été collectés et ensuite passés au crible pour détecter la présence de bactéries dégradant le caoutchouc. L’isolement de deux nouveaux actinomycètes appartenant au genre Gordonia (Ancien Gordona) après enrichissement sur du matériel de pneu granulaire a déjà été rapporté ., Un des échantillons a été enrichi sur du concentré de latex NR en culture liquide qui a montré une augmentation substantielle de la turbidité et une désintégration considérable du matériau de latex solide qui a été initialement coagulé complètement en une touffe dans les conditions de culture choisies (agitation à 180 tr / min en MSM). Cette culture d’enrichissement a ensuite été testée pour la croissance sur des plaques de film de latex. L’incubation nocturne a révélé des zones verdâtres sur le film de latex., Un enrichissement supplémentaire à partir de ces zones sur les plaques LB a révélé des colonies uniques d’un isolat bactérien, désigné sous le nom de souche AL98, qui a formé des colonies verdâtres sur les plaques LB après 1 jour et a également conduit à une coloration verdâtre foncé de la gélose LB après 2 jours. La croissance sur les plaques de film de latex s’est produite sous la forme d’un biofilm sans formation classique de colonies, provoquant une coloration verdâtre des deux, du matériau de latex qui était en contact direct avec les cellules et de la gélose MSM., Cette couleur verdâtre s’est transformée en une légère couleur rougeâtre pendant une incubation prolongée (>1 semaine); cela s’est accompagné d’un dégagement du film de latex dans la zone du biofilm. Aucune croissance de la souche n’a pu être déterminée sur des plaques de recouvrement en latex.

3.2 classification taxonomique

La Souche AL98 était une bactérie mobile, Gram-négative, oxydase-positive et catalase-positive en forme de bâtonnet (0,5 µm par 2 à 3 µm). En raison de ces caractéristiques, une analyse d’identification par le système BBL Oxi/Ferm Tube II a été réalisée., Par la suite, le schéma d’utilisation du substrat a révélé les résultats suivants: croissance sur l’arginine, le N2, le xylose, le glucose (aérobie), l’urée et le citrate; aucune croissance sur le glucose (anaérobie), le lactose, le saccharose, l’indole, le maltose, le mannitol et la phénylalanine; réaction indistincte pour la lysine. Le code numérique obtenu a abouti à une classification de P. aeruginosa, quel que soit le résultat de la réaction de lysine.

une caractérisation taxonomique plus poussée de la souche AL98 a été réalisée par analyse du gène de l’ARNr 16S. Le gène presque complet a été séquencé composé de 1530 nucléotides., Selon les résultats de la recherche de la base de données EMBL, la séquence a révélé des similitudes les plus élevées allant de 99,9% à 100% avec plusieurs souches de P. aeruginosa répertoriées. Les similitudes les plus élevées suivantes étaient de 98,7% avec Pseudomonas resinovorans et de 97,7% avec Pseudomonas alcaligenes. Selon Moore et coll. Les souches de P. aeruginosa possèdent une région de 32 PB dans leur ADNR 16S, correspondant aux positions D’E. coli 66-103, qui est hypervariable parmi les différentes espèces du genre Pseudomonas, mais conservée à 100% parmi les souches de P. aeruginosa. Exactement la même séquence, qui est typique de P., aeruginosa, a également été déterminée pour la souche AL98 aux positions 58-89. Les données de séquence du gène de l’ARNr 16S ont été soumises à la base de données de séquence nucléotidique EMBL et sont répertoriées sous le numéro d’adhésion. AJ249451. La souche AL98 a été déposée dans la collection de culture de L’Institut für Mikrobiologie, Münster, Allemagne, sous le nom de P. aeruginosa AL98.

3.3 désintégration du caoutchouc naturel

des cultures pures de P. aeruginosa AL98 ont été obtenues à partir de plaques LB après plusieurs passages sur ce milieu et testées pour la croissance sur du concentré de latex NR., La désintégration Visible du caoutchouc coagulé n’a commencé qu’après 2-3 semaines d’incubation. En revanche, lorsque des cellules AL98 provenant de cultures de latex ont été utilisées comme inoculum, la désintégration du matériau a déjà commencé après 2 jours. Si ces « cellules adaptées » ont ensuite été soumises à plusieurs passages sur des plaques LB, là encore un début retardé du processus de désintégration du caoutchouc a été observé. Il a été généralement observé que la croissance était encore plus retardée plus les passages sur le milieu LB étaient effectués. L’observation simultanée par microscopie optique n’a révélé en tout cas qu’un seul type de bâtonnets mobiles., Cependant, les cellules lavées provenant de cultures adaptées avaient généralement tendance à s’adsorber sur les parois des tasses D’Eppendorf ou des tubes de verre utilisés pour le lavage, contrairement aux cellules issues de cultures LB, qui étaient microscopiquement identiques aux cellules issues d’une culture en latex, mais ne présentaient aucune propriété adhésive. Les tests de croissance effectués avec plusieurs autres souches de P. aeruginosa provenant de différentes collections de culture, telles que PAO1, DSM 50071, DSM 939 et ATCC 27853, n’ont révélé aucune croissance sur le caoutchouc naturel et ont même montré une diminution du nombre de cellules vivantes pendant l’incubation sur des milieux contenant du caoutchouc (données non présentées).

3.,4 croissance sur cis-1,4-polyisoprène

plusieurs matériaux contenant de L’IR ont été utilisés comme seules sources de carbone pour déterminer la capacité et l’étendue de la croissance de P. aeruginosa AL98 sur des caoutchoucs: concentré de latex NR, qui contient >90% en poids sec de gants en latex IR, Nr, qui correspondent à du nr vulcanisé, c’est-à-dire avec des liaisons croisées entre les chaînes polymères, ainsi que de L’IR synthétique brut. Dans tous les cas, la croissance a été déterminée avec des cellules adaptées. Figue. 1A se réfère à l’évolution temporelle de la minéralisation des substrats en caoutchouc., Pour l’évaluation du rejet de CO2, on a supposé que les caoutchoucs utilisés étaient entièrement constitués de carbone. Après 6 semaines, la meilleure minéralisation a été détectée avec du concentré de latex NR (36%), suivi de gants en latex NR (26%) et de L’IR (21%). En outre, des augmentations de la biomasse des mêmes cultures ont également été détectées pour les trois substrats, comme le montre la Fig. 1B montrant l’évolution temporelle du nombre de cellules vivantes pendant l’incubation sur ces substrats., Malgré le comportement de croissance préférentiellement adhésif, une augmentation du nombre de cellules en suspension dans le milieu pendant la culture avec du concentré de latex NR (35 fois), du gant de latex NR (11 fois) ainsi que de L’IR (sept fois) s’est produite.

3.5 MEB et autres analyses de surfaces en caoutchouc

le comportement de colonisation et la formation de biofilm de P. aeruginosa AL98 sur le matériau de gant en latex NR ont été étudiés par MEB (fig. 2)., Comparé à un témoin non inoculé (Fig. 2A), la surface du caoutchouc a été entièrement recouverte d’un biofilm après une période de culture de 6 semaines (fig. 2B). Figue. 2C montre des cellules fusionnant dans le matériau en caoutchouc, ce qui s’est produit après 2 semaines, alors qu’après 6 semaines d’incubation, une désintégration supplémentaire du matériau est devenue visible (Fig. 2D).

la formation de Biofilm a également été démontrée après 6 semaines en colorant les gants en latex envahis par la végétation avec le réactif de Schiff., La couleur Pourpre produite par le réactif a fourni la preuve que des produits de dégradation contenant des groupes aldéhyde ont été produits et accumulés pendant la dégradation microbienne, comme L’a récemment rapporté Tsuchii .

une désintégration complète du matériau des gants a également été observée après des périodes de culture prolongées de plus de 3 mois., Les premières expériences pour optimiser ce processus de désintégration ont abouti à une dégradation beaucoup plus accélérée des gants, lorsque le MSM a été remplacé de temps en temps par du MSM frais pendant la culture par lots liquides, indiquant que la culture semi-continue est une stratégie possible pour améliorer le taux de dégradation, comme découvert précédemment pour une souche Nocardia dégradant le caoutchouc .

la croissance de P. aeruginosa AL98 sur IR est montrée dans les micrographies SEM de la Fig. 3. La formation de Biofilm était déjà visible après 1 semaine de culture. Figue. 3B montre des tiges AL98 colonisant la surface du caoutchouc, et Fig., 3C montre les cellules fusionnant dans le caoutchouc et les contacts forts entre les cellules au moyen de pilli. Enfin, Fig. 3D illustre une région du biofilm formé après 4 semaines sur la surface INFRAROUGE.

4 Discussion

Les procédures de dépistage pour l’isolement des bactéries dégradantes du caoutchouc ont conduit à la culture pure de la bactérie à Gram négatif AL98 avec une capacité accrue de désintégrer le caoutchouc naturel brut et vulcanisé ainsi que l’IR synthétique. Des études taxonomiques incluant l’analyse de l’ARNr 16S ont révélé que cette bactérie était un membre de L’espèce P. aeruginosa. Ces résultats fournissent des preuves qu’à côté des actinomycètes, les bactéries Gram-négatives sont également de puissants dégradants du NR et de L’IR. Classification taxonomique de la souche AL98 à P., aeruginosa, qui est l’une des espèces bactériennes les mieux étudiées, offre des avantages en ce qui concerne l’élucidation des bases physiologiques et génétiques de la dégradation du caoutchouc, car les bactéries dégradantes du caoutchouc appartenant au groupe des actinomycètes ne sont presque pas accessibles aux méthodes génétiques.

P. aeruginosa AL98 a montré une croissance adhésive vers les caoutchoucs solides d’une manière analogue à celle récemment montrée pour certains actinomycètes ., Semblable à ces bactéries, la souche AL98 a exprimé de fortes propriétés de décomposition du caoutchouc et n’a pas produit de zones de compensation (halos translucides) sur les plaques de recouvrement de latex comme d’autres décomposeurs de caoutchouc plus faibles isolés précédemment .

la diminution observée de la propriété dégradante du caoutchouc après transfert successif sur le milieu nutritif LB révèle que cette capacité de P. aeruginosa AL98 n’est pas stable. D’autre part, l’activité dégradante du caoutchouc pourrait être rétablie après une adaptation de longue durée sur un substrat en caoutchouc. La raison en est encore inconnue et doit être examinée en détail., Il est possible que L’AL98 recèle des plasmides codant l’information génétique pour la dégradation du caoutchouc, qui est perdue après culture successive sur milieu complexe. Cependant, les premiers essais pour isoler des plasmides de dégradation putative à partir de cultures al98 adaptées par la méthode de lyse alcaline selon n’ont donné aucune indication pour cela. D’autre part, les études SEM de colonisation IR ont révélé qu’il y avait un fort contact entre les cellules par pili (Fig. 3C), de sorte qu’un transfert d’informations génétiques d’une cellule à une autre pourrait théoriquement se produire.,

la coloration avec le réactif de Schiff a révélé que des groupes aldéhydes se sont formés à la surface du caoutchouc pendant la dégradation. Cette découverte correspond bien aux résultats obtenus par un examen analogue d’une souche de Nocardia décrite précédemment . Des études antérieures avec cet isolat ont montré que des oligomères contenant des groupes carbonyle à leurs extrémités se sont formés lors de la dégradation indiquant une scission oxydative de la chaîne IR au niveau des doubles liaisons . Un examen plus approfondi doit préciser si ce schéma convient également à P. aeruginosa AL98., Au cours d’études préliminaires, dans lesquelles la croissance de cellules al98 adaptées sur du charbon de bas rang en tant que seule source de carbone constituée de structures de type lignine a été testée, une augmentation de près de huit fois le nombre de cellules vivantes en suspension a été observée après une période de culture de 10 Semaines (données non présentées). La production de biomasse à partir de ce substrat implique également une dégradation oxydative du polymère de type lignine.

Remerciements

Nous tenons à remercier M. Mahmoud M. Berekaa pour son aide lors de la préparation du substrat IR pour SEM., La description de la méthode de coloration avec le réactif de Schiff par le Dr Akio Tsuchii de L’Institut National de Bioscience et de technologie humaine, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japon, est vivement saluée. En outre, les auteurs apprécient le travail photographique expert de Mme G. Kiefermann de L’Institut für Medizinische Physik und Biophysik.