una bacteria Gram-negativa, identificada como Pseudomonas aeruginosa AL98, es un potente degradador de caucho natural y sintético cis-1,4-poliisopreno

resumen

una bacteria Gram-negativa, cepa AL98, fue aislada de un neumático de coche deteriorado en un campo de agricultores en Münster, Alemania., La cepa fue capaz de desintegrar considerablemente el caucho natural (NR), ya sea en estado bruto como concentrado de látex NR o en estado vulcanizado como guante de látex NR, así como CIS-1,4-poliisopreno sintético crudo (IR). La determinación de la evolución del dióxido de carbono y el número de células vivas durante el cultivo por lotes con cada uno de los materiales como única fuente de carbono, reveló la mineralización del polímero de caucho durante el aumento de la biomasa., La investigación de la superficie por microscopía electrónica de barrido dio evidencia de un comportamiento de crecimiento adhesivo de la deformación que procedía colonizando la superficie del caucho, fundiéndose en el caucho y formando una biopelícula antes de la desintegración del material. La tinción de reactivo de Schiff realizada con guantes de látex NR indicó la producción y acumulación de grupos aldehídos durante la colonización. El sustrato de guante sólido desapareció por completo después de un período de cultivo prolongado como resultado de la degradación continua., Los análisis taxonómicos de la cepa, que también se basaron en el examen de similitud del gen 16S rRNA completo, revelaron la clasificación de la cepa AL98 como una cepa de Pseudomonas aeruginosa. Este es el primer informe sobre el aislamiento de una bacteria gramnegativa que exhibe fuertes propiedades de descomposición del caucho.

1 Introducción

El caucho natural crudo (NR) para aplicaciones técnicas se obtiene como látex del árbol de caucho Hevea brasiliensis. Más del 90% del peso seco del látex consiste en cis-1,4-poliisopreno (IR) (Mw >106 Da)., Antes de la conversión en productos de caucho, se somete a un procesamiento posterior, como concentración, masticación y vulcanización, es decir, reticulación de las cadenas de polímeros. El IR también se puede sintetizar químicamente mejorando, pero no reemplazando, todas las propiedades del producto natural. Se sabe que ambos tipos de cauchos de poliisopreno son susceptibles a la acción microbiana . La mayoría de las bacterias degradantes de NR fueron identificadas como miembros del grupo de actinomicetos . Solo hay un informe sobre el tratamiento del látex NR con el extracto crudo extracelular de una bacteria gramnegativa, una Xanthomonas sp.,, dando lugar a la formación de oligómeros con Mw entre 103 y 104 Da . Sin embargo, la capacidad de esta cepa para colonizar y descomponer el caucho sólido era bastante pobre .

en esta comunicación, se reporta el aislamiento de la cepa degradante del caucho Al98, que fue identificada como representativa de la especie Pseudomonas aeruginosa, lo que indica que no solo los actinomicetos son potentes degradadores de NR e IR., Dado que los miembros de esta especie gramnegativa están fisiológica y genéticamente bien caracterizados, esta cepa puede ofrecer ventajas para el esclarecimiento de las causas fisiológicas y genéticas de la degradación del caucho.

2 Materiales y métodos

2.1 cauchos

El concentrado de látex NR (Neotex Latz) se obtuvo de Weber y Schaer (Hamburgo, Alemania) e IR (SKI3) de Continental AG (Hannover, Alemania). Los guantes de látex NR (rotiprotect™) se compraron a Roth (Karlsruhe, Alemania).

2.,2 cultivos

se realizaron cultivos líquidos en frascos Erlenmeyer de 300 ml que contenían un medio de sales minerales (MSM), como se describió anteriormente . El concentrado de látex NR se añadió al 0,8% (v/v) a 30 ml MSM, lo que corresponde al 0,5% de materia seca (p/v) considerando las especificaciones del proveedor. Los guantes de látex NR se cortaron en trozos pequeños de 0,15 g, y cada uno se añadió sin tratamiento adicional a 30 ml MSM. La RI se cortó en trozos pequeños de aproximadamente 2-3 mm de diámetro, se extrajo con acetona (1-2 días) y se añadieron 0,15 g a 30 ml MSM., La esterilización por calor previa a la inoculación se realizó en autoclave.

para microscopía electrónica de barrido (SEM), se prepararon cultivos IR de la siguiente manera: se disolvieron 3 g de caucho IR extraído de acetona en 100 ml de cloroformo para dar una solución IR al 3%. Las piezas rectangulares delgadas de aluminio con una superficie de aproximadamente 1 cm2 se sumergieron en esta solución y se secaron en una corriente de aire. Este procedimiento se repitió hasta que ambos lados de las piezas de aluminio se cubrieron completamente con material IR., Las piezas recubiertas se esterilizaron con etanol al 96% y se añadieron a 30 ml de solución MSM ya esterilizada en autoclave en matraces de 300 ml. Las células se precultivaron durante la noche a 30 ° C En medio complejo Luria-Bertani (LB) de 10 ml, se lavaron dos veces con solución salina, se resuspendieron en 1 ml de solución salina y se inocularon 10 µl a los cultivos que contenían caucho. Los matraces inoculados se incubaron a 30 ° C y se agitaron a 180 rpm.

se realizaron cultivos sólidos en placas de Petri que contenían agar lb o agar látex MSM., Por lo tanto, se utilizaron dos tipos de placas de agar de látex: (1) placas de película de látex, preparadas esparciendo el concentrado de látex como una película delgada directamente sobre agar MSM, y (2) placas de recubrimiento de látex, preparadas vertiendo una capa delgada de agar MSM que contiene concentrado de látex NR disperso a una concentración de 0,02% (P/v) por encima del agar MSM que no contiene fuente de carbono. La incubación de las placas inoculadas se realizó a 30°C.,

El Patrón de utilización del sustrato se llevó a cabo utilizando el sistema de identificación bacteriana BBL Oxi/Ferm Tube II (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, EE.

2.3 mineralización

La medición de la mineralización se realizó en matraces herméticos de Erlenmeyer de 500 ml mediante la determinación de la liberación de CO2 después de diferentes períodos de cultivo, como se describió recientemente . La cantidad de sustrato de caucho proporcionado comprendió en todos los casos 0,25 g en 50 ml de MSM.

2.,4 tinción con el reactivo de Schiff

recientemente se ha demostrado la tinción de los guantes de látex NR con el reactivo de Schiff . El procedimiento análogo aplicado aquí fue el siguiente: en una botella herméticamente tapada, se agregaron 10 ml del reactivo de fucsina a una muestra, y el color púrpura se desarrolló durante 10-30 min a temperatura ambiente. Se descartó el exceso de reactivo y se añadieron 10 ml de solución de sulfito para suprimir la reacción de color no específica de la muestra en blanco., La composición del reactivo de fucsina fue la siguiente: 2 g de fucsina disuelta en 50 ml de ácido acético glacial más 10 g de Na2S2O5 más 100 ml de HCl 0.1 N más 50 ml de H2O. la composición de la solución de sulfito fue: 5 g de Na2S2O5 más 5 ml de HCl concentrado (37-38%), ad 100 ml con H2O.

2.5 Microscopía Electrónica de barrido

NR-guantes de látex y se tomaron piezas de aluminio delgadas recubiertas de ir de cultivos líquidos en diferentes períodos de cultivo, fijadas con 2.5% de glutaraldehído en tampón de fosfato de 0.1 M (PBS; pH 7.3) según Sørensen ., Después del lavado con PBS, los cultivos se postfijaron en tetróxido de osmio al 1% en PBS 0.1 M (pH 7.3) y se deshidrataron en etanol clasificado(30%, 50%, 70%, 90%, 96% y etanol absoluto). Las muestras deshidratadas fueron sometidas al punto crítico de secado con CO2 líquido según el procedimiento estándar. Posteriormente, las muestras se montaron en columpios de muestras de aluminio utilizando carbono conductor eléctrico (PLANO, Wetzlar, Alemania) y recubierto de pulverización catódica con aproximadamente 15 nm de oro utilizando gas argón como plasma ionizante. Las imágenes se realizaron con un microscopio electrónico de barrido S-450 (SEM; Hitachi Ltd.,, Japón) con electrones secundarios a una tensión de aceleración de 20 kV y a temperatura ambiente. Se registraron micrografías a partir de un tubo de rayos catódicos de alta resolución utilizando una película negativa (Agfapan, APX 100).

2.6 el análisis del ADNr 16S

La extracción del ADN genómico se realizó como se describió anteriormente . La amplificación del gen 16S rRNA se realizó utilizando oligonucleótidos como cebadores como se describe en . Las secuencias de nucleótidos del producto de PCR purificado se determinaron con un secuenciador de ADN de 4000L (LI-COR Inc.,, Biotechnology Division, London, NE, USA) and a Thermo Sequenase fluorescence-labelled primer cycle-sequencing kit (Amersham Life Science, Little Chalfont, UK) as specified by the manufacturers employing the primers described in . Las secuencias del ADNr 16S se alinearon manualmente con secuencias publicadas de Representantes de pseudomonadas obtenidas del EMBL.

3 Resultados

3.,1 Aislamiento de la cepa AL98

se recolectaron muestras ambientales de agua sucia dentro de neumáticos de automóviles deteriorados en un campo de un agricultor en Münster, Alemania, y posteriormente se examinaron para detectar la aparición de bacterias degradantes del caucho. El aislamiento de dos actinomicetos nuevos pertenecientes al género Gordonia (ex Gordona) después del enriquecimiento en material de neumático granular fue reportado previamente ., Una de las muestras fue enriquecida en concentrado de látex NR en cultivo líquido que mostró un aumento sustancial en la turbidez y una desintegración considerable del material de látex sólido que inicialmente se coaguló completamente en un grupo bajo las condiciones de cultivo elegidas (agitación a 180 rpm en MSM). Este cultivo de enriquecimiento se probó posteriormente para su crecimiento en placas de película de látex. La incubación nocturna reveló áreas verdosas en la película de látex., El enriquecimiento adicional de estas áreas en las placas LB reveló colonias individuales de un aislado bacteriano, designado como cepa AL98, que formó colonias verdosas en las placas lb después de 1 día y también condujo a una tinción verdosa oscura del agar lb después de 2 días. El crecimiento en placas de película de látex se produjo como un biofilm sin formación clásica de colonias causando manchas verdosas de ambos, el material de látex que estaba en contacto directo con las células y también el agar MSM., Este color verdoso se convirtió en un color rojizo tenue durante la incubación prolongada (>1 semana); esto fue acompañado por una limpieza de la película de látex en el área del biofilm. No se pudo determinar el crecimiento de la cepa en placas de recubrimiento de látex.

3.2 clasificación taxonómica

La Cepa Al98 fue una bacteria móvil, Gram-negativa, oxidasa-positiva y catalasa-positiva en forma de bastoncillo (0.5 µm por 2 a 3 µm). Debido a estas características, se realizó el análisis de identificación por el sistema BBL Oxi/Ferm Tube II., Posteriormente, el patrón de utilización del sustrato reveló los siguientes resultados: crecimiento en arginina, N2, xilosa, glucosa (aeróbica), urea y citrato; no crecimiento en glucosa (anaeróbica), lactosa, sacarosa, indol, maltosa, manitol y fenilalanina; reacción indistinta para la lisina. El código numérico obtenido resultó en una clasificación a P. aeruginosa, independientemente del resultado de la reacción de lisina.

se realizó una caracterización Taxonómica adicional de la cepa AL98 mediante el análisis del gen 16S rRNA. El gen casi completo fue secuenciado consistente en 1530 nucleótidos., De acuerdo con los resultados de la búsqueda de la base de datos EMBL, la secuencia reveló similitudes más altas que van desde el 99,9% al 100% a varias cepas de P. aeruginosa enumeradas. Las siguientes similitudes más altas fueron 98,7% a Pseudomonas resinovorans y 97,7% a Pseudomonas alcaligenes. Según Moore et al. Las cepas de P. aeruginosa poseen una región 32-bp en su ADNr 16S, correspondiente a las posiciones de E. coli 66-103, que es hipervariable entre diferentes especies del género Pseudomonas, pero 100% conservada entre las cepas de P. aeruginosa. Exactamente la misma secuencia, que es típica de P., aeruginosa, también se determinó para la cepa AL98 en las posiciones 58-89. Los datos de la secuencia del gen 16S rRNA se han enviado a la base de datos de la secuencia de nucleótidos del EMBL y se enumeran bajo el número de acceso. AJ249451. La cepa AL98 fue depositada en la colección de cultivos del Institut für Mikrobiologie, Münster, Alemania, como P. aeruginosa AL98.

3.3 desintegración de caucho natural

los cultivos puros de P. aeruginosa AL98 se obtuvieron de placas LB después de varios pasajes en este medio y se probaron para el crecimiento en concentrado de látex NR., La desintegración Visible del caucho coagulado comenzó solo después de 2-3 semanas de incubación. Por el contrario, cuando se utilizaron células AL98 de cultivos de látex como inóculo, la desintegración del material ya comenzó después de 2 días. Si estas «células adaptadas» fueron posteriormente sometidas a varios pasajes en placas LB, nuevamente se observó un inicio retardado del proceso de desintegración del caucho. En general, se observó que el crecimiento se retrasaba aún más a medida que se realizaban más pasajes en el medio LB. La observación simultánea por microscopía de luz reveló en cualquier caso solo un tipo de varillas móviles., Sin embargo, las células lavadas de cultivos adaptados tendían generalmente a adsorberse en las paredes de las copas de Eppendorf o los tubos de vidrio utilizados para el lavado en contraste con las células de cultivos LB, que eran microscópicamente idénticas a las células de cultivos de látex, pero no mostraban propiedades adhesivas. Las pruebas de crecimiento realizadas con varias otras cepas de P. aeruginosa de diferentes colecciones de cultivos, como PAO1, DSM 50071, DSM 939 y ATCC 27853, no revelaron crecimiento en caucho natural e incluso mostraron una disminución en el número de células vivas durante la incubación en medios que contienen caucho (datos no mostrados).

3.,4 crecimiento en cis-1,4-poliisopreno

Se utilizaron varios materiales que contienen IR como fuentes únicas de carbono para determinar la capacidad y el grado de crecimiento de P. aeruginosa AL98 en cauchos: concentrado de látex NR, que contiene >90% de peso seco de guantes de látex IR, NR, que corresponden a NR vulcanizado, es decir, con enlaces cruzados entre las cadenas de polímeros, así como ir sintético en bruto. En todos los casos se determinó el crecimiento con células adaptadas. Higo. 1A se refiere al curso del tiempo de mineralización de los sustratos de caucho., Para la evaluación de la liberación de CO2, se asumió que los cauchos empleados consistían totalmente en carbono. Después de 6 semanas, la mejor mineralización se detectó con concentrado de látex NR (36%), seguido de guantes de látex NR (26%) e IR (21%). Además, también se detectaron aumentos de la biomasa de los mismos cultivos para los tres sustratos, como se muestra en la Fig. 1B mostrando el curso de tiempo del recuento de células vivas durante la incubación en estos sustratos., A pesar del comportamiento de crecimiento preferentemente adhesivo, se produjo un aumento en el número de células suspendidas en el medio durante el cultivo con concentrado de látex NR (35 veces), guante de látex NR (11 veces) e IR (siete veces).