el crecimiento y mantenimiento de microbios en medios que contienen agar en placas de Petri ha sido durante mucho tiempo una práctica común en microbiología. Tradicionalmente, el método preferido para el análisis cuantitativo de la población de cultivos puros y mixtos se basa en el recubrimiento de diluciones en serie y el posterior recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)., En los últimos años, una gama de métodos alternativos de alto rendimiento (HT) que dependen de la PCR cuantitativa (Neeley et al. 2005; Haarman y Knol 2006), fluorescent labelling (Blasco et al. 2003; Lay et al. 2005) o sondeo del genoma con micro matrices (Bae et al. 2005) han ganado popularidad (Liu et al. 2004a). Sin embargo, la mayoría de estos métodos miden diferentes entidades, es decir, todas las células, incluidas las células no viables. Además, estos métodos pueden requerir el uso de equipo especial o el desarrollo extenso de protocolos., Además, algunos de estos métodos son poco compatibles con sustratos complejos y muestras ambientales. Esto explica en gran medida por qué la enumeración de microbios mediante el recuento de colonias sigue siendo una metodología ampliamente aplicada. En la actualidad, la microbiología se está moviendo cada vez más hacia los análisis de HT, que pueden requerir el uso de grandes cantidades de placas. Esto resulta en graves inconvenientes cuando se utilizan técnicas convencionales de chapado y conteo de colonias. La preparación de medios y placas, así como el recuento de colonias, requiere mucho tiempo y trabajo., Además, los grandes volúmenes pueden dar lugar a costes significativos, en particular cuando se utilizan sustratos indicadores o informadores costosos. Por último, muchos métodos consumen grandes cantidades de materiales, incluidos los desechables, lo que compromete su sostenibilidad.
varios informes describen tecnologías de chapado alternativas en las que los volúmenes requeridos se reducen (Jett et al. 1997; McNulty y Dunn 1999; Tornero y Dangl 2001; Hamilton et al. 2002)o el proceso de conteo de colonias es automatizado (Marotz et al. 2001; Dahle et al. 2004; Putman et al. 2005)., Sin embargo, estos ejemplos requieren equipos que no están presentes en los laboratorios de Microbiología estándar (Gilchrist et al. 1973; Liu et al. 2004b), puede resultar solo en una reducción de escala limitada (Gilchrist et al. 1973; Jett et al. 1997; Hamilton et al. 2002), o son poco adecuados para la automatización (McNulty y Dunn 1999; Hamilton et al. 2002). Sobre la base de este trabajo, informamos de un método simple y flexible para determinar los recuentos de células aprovechando los formatos de placas de microtitulado., Integra un rápido recubrimiento miniaturizado y un conteo (semi) automatizado de minicolonies, lo que permite una reducción del proceso de 100 veces en comparación con los procedimientos de conteo convencionales de UFC. Se puede operar completamente con poco más que una pipeta multicanal, una cámara digital e ImageJ, un paquete de procesamiento de imágenes que está disponible como freeware (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Se presentan varios ejemplos para ilustrar el poder del enfoque para la evaluación rápida de recuentos viables de microorganismos industriales procariotas y eucariotas importantes.,
para el enchapado, utilizamos diluciones en serie de 10 veces que se prepararon en placas micro de 96 pocillos utilizando una pipeta Genex Alpha de 12 canales (Genex Labs, Torquay, Reino Unido). Para cada dilución, se pipetearon muestras de cinco µl en un medio de agar que contenía una placa utilizando la misma pipeta. Típicamente, se aplicaron de 60 a 120 gotitas por placa cuadrada de 12 cm. Las placas se secaron al aire y luego se incubaron hasta que las colonias fueron visibles con un tamaño promedio de 200-500 µm. Posteriormente, estas minicolonías fueron fotografiadas con una cámara digital de alta resolución Canon EOS 350D (Canon 0020×665; Canon Inc.,, Japón) equipado con un objetivo Sigma 105 mm macro (AF 105mm F2 * 8 EX MACRO F; Sigma Corporation, Japón). Las placas se colocaron sobre una superficie negra y se iluminaron desde el lado para lograr un gran contraste entre las colonias y el fondo.
Las imágenes digitales se procesaron posteriormente en ImageJ utilizando un plug‐in recién desarrollado que se puede descargar como información de apoyo. El proceso de conteo se representa esquemáticamente en la Fig. S1. Brevemente, las imágenes en color fueron convertidas en escala de grises de 8 bits e invertidas., Mediante intervención manual utilizando la función ‘threshold’ de ImageJ; las colonias fueron seleccionadas del fondo. Luego todas las fotos fueron apiladas. Después de la inversión, la mediana se tomó de cada píxel con sus píxeles vecinos para reducir el ruido. La función «cuenca hidrográfica» se utilizó para separar colonias fusionadas y la función «analizar partículas» se utilizó para el recuento. La salida se guardó como un archivo de texto y posteriormente se procesó en Microsoft Excel.,
en nuestro estudio, nuestro objetivo específico fue desarrollar protocolos de conteo rápido de UFC para microbios industriales, incluidas las bacterias del ácido láctico, Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae. Cuando estas cepas son enumeradas por el conteo convencional de UFC, típicamente entre 30 y 300 colonias por placa de Petri de agar estándar de 8 cm de diámetro resulta en un conteo óptimo. Un número mayor puede resultar fácilmente en una subestimación, ya que las colonias individuales no pueden ser discriminadas., El bajo número de colonias por placa resulta en grandes desviaciones estándar, que es la raíz cuadrada del promedio en la distribución de Poisson. Esto implica que en el caso de que se cuenten cinco colonias, el número de células en las muestras plateadas está entre 1 y 9 con una confianza del 95%, mientras que para 100 células estos valores son 80 y 120. En este último caso, el intervalo de confianza del 95% es una desviación del 20% del promedio. Por lo tanto, nuestro objetivo era desarrollar un protocolo que permitiera el recuento de al menos 100 colonias., Esto implica que, en cualquier proceso de reducción de escala del conteo de placas, es crucial aumentar el número de colonias que se pueden contar por cm2 de superficie de agar. En nuestros experimentos, esto se logró contando minicolonies con un tamaño de 200-500 µm. Por lo tanto, las colonias fueron contadas tan pronto como las minicolonias son visibles, lo que es más temprano de lo que normalmente se hace con el conteo convencional. Además, el crecimiento de muchas colonias en una superficie relativamente pequeña resulta en colonias más pequeñas, por ejemplo, debido a la disponibilidad limitada del sustrato (Liu et al. 2004b)., Esto aumenta efectivamente el número de colonias que se pueden contar por cm2 de superficie de agar.
utilizamos los procedimientos descritos anteriormente para realizar el conteo viable de varios microorganismos industriales y marcamos estos datos en banco a los procedimientos de conteo convencionales. Por lo tanto, Streptococcus thermophilus CNRZ1066, Lactococcus lactis MG1363, Lact. plantarum Wcfs1, E. coli DH5a y S. cerevisiae CBS57957 se cultivaron en medios apropiados (Tabla 1) durante aproximadamente 24 h a 37°C. las diluciones de cultivo se prepararon en placas de 96 pocillos en 12 pliegues y se platearon utilizando ambos métodos., Para el método convencional, se pipetearon muestras de 50 µl en una placa de agar redonda de 8 cm de diámetro con un Gilson pipetman P100 y se extendieron con un hisopo de vidrio. Los recuentos promedio de UFC fueron comparables y las desviaciones estándar comparables o menores con el método de minicolonía, confirmando la idoneidad del método para el conteo rápido de UFC. A partir de las desviaciones estándar de la tabla 1, se puede concluir que la sensibilidad del método rápido es comparable al método convencional, aunque la variación entre recuentos puede diferir con el tipo de pipetas utilizadas, como argumentaron previamente Jett et al., (1997).
Por ejemplo, Lact. las manchas plantares que contenían minicolonias tenían alrededor de 9 mm de diámetro y, por lo tanto, es posible contar hasta 200 colonias por cm2 de manera eficiente en agar MRS‐galactosa, que es típicamente de uno a dos órdenes de magnitud mayor que con el chapado convencional. Encontramos que los tamaños de manchas y minicolonias pueden variar con el tipo de medio de agar, el tiempo de secado, la matriz de la muestra y la especie de interés (no mostrada)., Puede afectar el número de colonias que se pueden enumerar por 5 µl de punto, típicamente en el rango entre 10 y 150, pero no en el número de colonias que se pueden contar por cm2 para esta cierta especie. El límite de detección del método de minicolonia es similar al del método convencional. El rango dinámico del nuevo método se encontró igual al método convencional (no se muestran los datos).
en los últimos años, se han desarrollado alternativas y variantes de HT para muchas técnicas microbiológicas convencionales., Los mejores ejemplos son probablemente los cultivos por lotes líquidos para los cuales varias alternativas de pozos múltiples pertenecen a equipos de laboratorio estándar hoy en día. También se reportan varias alternativas de HT para el conteo de UFC (Dahle et al. 2004; Liu et al. 2004b; Putman et al. 2005). Los rendimientos se incrementan al centrarse en la automatización del proceso de conteo o en la miniaturización del propio chapado., La novedad del método que aquí se informa se basa en la integración de estos aspectos, mientras que solo requiere equipo de laboratorio estándar, una cámara digital, software de imágenes que está disponible como software gratuito y un plug‐in dedicado que está disponible como Material complementario a este documento. El protocolo de recubrimiento y conteo rápido resultante es adecuado para una determinación rápida de recuentos de células viables. El método es muy flexible, ya que se puede implementar fácilmente para diferentes especies microbianas y es fácil de usar., Debido a su miniaturización, reduce la cantidad de materiales necesarios en aproximadamente 100 veces, lo que lo convierte en una alternativa rentable y eficiente para los métodos convencionales. Debido a que el conteo está parcialmente automatizado, el usuario puede monitorear los pasos críticos en la adquisición y procesamiento de datos sin la variabilidad encontrada en el conteo manual de las UFC (Lumley et al. 1997). Anticipamos que este protocolo es una herramienta valiosa para la enumeración rutinaria de microbios industriales en laboratorios de investigación y control de calidad.
