Un Gram-negative bacteria, identificate ca Pseudomonas aeruginosa AL98, este un puternic degrader de cauciuc natural și sintetic cis-1,4-poliizopren

Abstract

Un Gram-negative bacteria, tulpina AL98, a fost izolat din apă fault în interiorul unui deteriorat cauciuc de mașină pe un câmp din Münster, Germania., Tulpina a fost capabilă să dezintegreze considerabil cauciucul natural (NR), fie în stare brută ca concentrat de latex NR, fie în stare vulcanizată ca mănușă de latex NR, precum și CIS-1,4-poliizopren sintetic brut (IR). Determinarea evoluției dioxidului de carbon și a numărului de celule vii în timpul cultivării lotului cu fiecare dintre materiale ca sursă unică de carbon, a evidențiat mineralizarea polimerului de cauciuc în timpul creșterii biomasei., Investigarea suprafeței prin microscopie electronică cu baleiaj a dat dovezi pentru un comportament de creștere adeziv al procedurii de tulpină prin colonizarea suprafeței de cauciuc, fuzionarea în cauciuc și formarea unui biofilm înainte de dezintegrarea materialului. Colorarea reactivului Schiff efectuată cu mănuși de latex NR a indicat producerea și acumularea grupărilor aldehide în timpul colonizării. Substratul solid al mănușii a dispărut complet după o perioadă de cultivare prelungită ca urmare a degradării continue., Analizele taxonomice ale tulpinii, care s-au bazat, de asemenea, pe examinarea similitudinii genei complete a ARNr 16S, au evidențiat clasificarea tulpinii AL98 ca tulpină a Pseudomonas aeruginosa. Acesta este primul raport despre izolarea unei bacterii Gram-negative care prezintă proprietăți puternice de descompunere a cauciucului.

1 Introducere

cauciucul natural brut (NR) pentru aplicații tehnice este obținut ca latex din arborele de cauciuc Hevea brasiliensis. Mai mult de 90% din greutatea uscată a latexului constă în cis-1,4-poliizopren (IR) (MW >106 Da)., Înainte de transformarea în produse din cauciuc, acesta este supus unei prelucrări ulterioare, cum ar fi concentrația, masticația și vulcanizarea, adică reticularea lanțurilor polimerice. IR poate fi, de asemenea, sintetizat chimic îmbunătățind astfel, dar nu înlocuind, toate proprietățile produsului natural. Ambele tipuri de cauciuc poliizopren sunt cunoscute a fi sensibile la acțiunea microbiană . Majoritatea bacteriilor degradante NR au fost identificate ca membri ai grupului de actinomicete . Există un singur raport despre tratamentul latexului NR cu extractul extracelular brut al unei bacterii Gram-negative, un Xanthomonas sp.,, conducând la formarea oligomerilor cu MW între 103 și 104 Da . Cu toate acestea, capacitatea acestei tulpini de a coloniza și de a descompune cauciucul solid a fost destul de slabă .în această comunicare, este raportată izolarea tulpinii degradante din cauciuc AL98, care a fost identificată ca reprezentant al speciei Pseudomonas aeruginosa, indicând faptul că nu numai actinomicetele sunt degradante puternice ale NR și IR., Deoarece membrii acestei specii Gram-negative sunt bine caracterizați fiziologic și genetic, această tulpină poate oferi avantaje pentru elucidarea cauzelor fiziologice și genetice ale degradării cauciucului.

2 Materiale și metode

2.1 Cauciucuri

latex NR concentrat (Neotex Latz) a fost obținut de la Weber și Schaer (Hamburg, Germania) și IR (SKI3) de la Continental AG (Hannover, Germania). Mănușile NR latex (rotiprotect™) au fost achiziționate de la Roth (Karlsruhe, Germania).

2.,2 culturi

culturile lichide au fost efectuate în flacoane Erlenmeyer de 300 ml care conțin un mediu de săruri minerale (MSM), așa cum s-a descris anterior . Concentratul de latex NR a fost adăugat la 0,8% (v/v) la 30 ml MSM, ceea ce corespunde la 0,5% substanță uscată (g/v) având în vedere specificațiile furnizorului. Mănușile din latex NR au fost tăiate în bucăți mici de 0,15 g și fiecare a fost adăugat fără tratament suplimentar la 30 ml MSM. IR a fost tăiat în bucăți mici de aproximativ 2-3 mm în diametru, extras cu acetonă (1-2 zile) și 0,15 g au fost adăugate la 30 ml MSM., Sterilizarea prin căldură înainte de inoculare s-a făcut într-o autoclavă.pentru microscopia electronică cu baleiaj (SEM), culturile IR au fost preparate după cum urmează: 3 g de cauciuc IR extras cu acetonă au fost dizolvate în 100 ml cloroform pentru a da o soluție IR 3%. Bucăți subțiri dreptunghiulare de aluminiu cu o suprafață de aproximativ 1 cm2 au fost scufundate în această soluție și uscate într-un curent de aer. Această procedură a fost repetată până când ambele părți ale pieselor de aluminiu au fost acoperite complet cu material IR., Piesele acoperite au fost sterilizate cu etanol 96% și adăugate la 30 ml de soluție MSM deja autoclavată în flacoane de 300 ml. Celulele au fost precultivate peste noapte la 30°C în 10 ml mediu complex Luria-Bertani (LB), spălate de două ori cu soluție salină, resuspendate în 1 ml soluție salină și 10 µl au fost inoculate culturilor care conțin cauciuc. Flacoanele inoculate au fost incubate la 30°C și agitate la 180 rpm.culturile solide au fost realizate în vase Petri care conțin fie agar LB, fie agar latex MSM., Astfel au fost utilizate două tipuri de plăci de agar latex: (1) plăci de film latex, preparate prin împrăștierea concentratului de latex ca o peliculă subțire direct pe agar MSM și (2) plăci de acoperire latex, preparate prin turnarea unui strat subțire de agar MSM care conține concentrat de latex nr dispersat la o concentrație de 0,02% (g/v) deasupra agarului MSM care nu conține sursă de carbon. Incubarea plăcilor inoculate s-a făcut la 30°C.,

modelul de utilizare a substratului a fost realizat utilizând sistemul de identificare bacteriană BBL Oxi/Ferm Tube ii (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, SUA), așa cum este specificat de producători.

2.3 mineralizare

măsurarea mineralizării a fost efectuată în flacoane etanșe de 500 ml Erlenmeyer prin determinarea eliberării de CO2 după diferite perioade de cultivare, așa cum s-a descris recent . Cantitatea de substrat de cauciuc furnizată a cuprins în toate cazurile 0,25 g în 50 ml MSM.

2.,4 colorarea cu reactivul Schiff

colorarea mănușilor de latex NR cu reactivul Schiff a fost prezentată recent . Procedura analogă aplicată aici a fost următoarea: într-o sticlă bine închisă, s-au adăugat 10 ml de reactiv fuchsin la o probă, iar culoarea purpurie a fost dezvoltată timp de 10-30 min la temperatura camerei. Cantitatea excesivă de reactiv a fost apoi aruncată și s-au adăugat 10 ml de soluție de sulfit pentru a suprima reacția de culoare nespecifică a probei goale., Compoziția fuksinom reactiv fost următoarele: 2 g fuksinom dizolvă în 50 ml acid acetic glacial plus 10 g Na2S2O5 plus 100 ml de 0,1 N HCl plus 50 ml H2O. Compoziția de sulfit soluția a fost: 5 g Na2S2O5 plus 5 ml HCl concentrat (37-38%), ad 100 ml cu H2O.

2.5 microscopia electronică de baleiaj

NR-mănuși de latex și IR-acoperite cu aluminiu subțire piesele au fost luate de lichid culturi la diferite perioade de cultivare, fix cu 2,5% glutaraldehidă în 0,1 M tampon fosfat (PBS; pH 7.3) potrivit Sørensen ., După spălarea cu PBS, culturile au fost postfixate în tetroxidă de osmiu 1% în PBS de 0,1 M (pH 7,3) și deshidratate în etanol gradat(30%, 50%, 70%, 90%, 96% etanol absolut). Probele deshidratate au fost supuse uscării în punctul critic cu CO2 lichid conform procedurii standard. Ulterior, probele au fost montate pe cioturi de aluminiu folosind carbon conductor electric (PLANO, Wetzlar, Germania) și acoperite cu pulverizare cu aur de aproximativ 15 nm folosind gaz argon ca plasmă ionizantă. Imagistica a fost realizată cu un microscop electronic cu baleiaj S-450 (sem; Hitachi Ltd.,, Japonia) cu electroni secundari la tensiunea de accelerație de 20 kV și la temperatura camerei. Micrografele au fost înregistrate dintr-un tub catodic de înaltă rezoluție folosind film negativ (Agfapan, APX 100).

2. 6 Analiza ADNR 16S

extragerea ADN-ului genomic a fost efectuată așa cum s-a descris anterior . Amplificarea genei ARNr 16S a fost efectuată utilizând oligonucleotide ca primeri, așa cum este descris în . Secvențele nucleotidice ale produsului PCR purificat au fost determinate cu un secvențiator ADN 4000L (LI-COR Inc.,, Biotechnology Division, Londra, NE, SUA) și un termo sequenase fluorescenta etichetate primer ciclu-secvențiere kit (Amersham Life Science, Little Chalfont, Marea Britanie) specificate de către producătorii care utilizează primerii descrise în . Secvențele ADNR 16S au fost aliniate manual cu secvențele publicate de la reprezentanții Pseudomonadelor obținute de la EMBL.

3 rezultate

3.,1 Izolarea tulpina AL98

probele de Mediu din apă fault în interiorul deteriorat anvelope auto pe un câmp din Münster, Germania, au fost colectate și ulterior analizate pentru apariția de cauciuc degradante bacterii. Izolarea a două actinomicete noi aparținând genului Gordonia (fostul Gordona) după îmbogățirea pe material granular de anvelope a fost raportată anterior ., Una dintre probe a fost îmbogățit pe latex NR concentrat în lichidul de cultură, care a arătat o creștere substanțială a turbidității și o considerabilă dezintegrarea solid, material latex, care a fost inițial coagulat complet la un mănunchi sub ales condițiile de cultivare (tremura la 180 rpm în MSM). Această cultură de îmbogățire a fost ulterior testată pentru creștere pe plăci de film din latex. Incubarea peste noapte a evidențiat zone verzui pe filmul de latex., În continuare îmbogățire din astfel de zone pe LB plăci dezvăluit singur colonii de bacterii izola, desemnat ca tulpina AL98, care a format verzui colonii pe LB plăci dupa 1 zi și, de asemenea, a condus la un verzui colorare a LB agar după 2 zile. Creșterea pe plăci de film de latex a avut loc ca un biofilm fără formarea coloniilor clasice care provoacă colorarea verzuie a ambelor, a materialului latex care a fost în contact direct cu celulele și, de asemenea, agarul MSM., Această culoare verzuie s-a transformat într-o culoare roșiatică slabă în timpul incubării prelungite (>1 săptămână); aceasta a fost însoțită de o curățare a filmului de latex din zona biofilmului. Nici o creștere a tulpinii nu a putut fi determinată pe plăcile de acoperire din latex.

3. 2 clasificare taxonomică

tulpina AL98 a fost o bacterie motilă, Gram-negativă, oxidază-pozitivă și catalază-pozitivă în formă de tijă (0, 5 µm cu 2 până la 3 µm). Datorită acestor caracteristici, s-a efectuat analiza de identificare prin sistemul BBL Oxi/Ferm Tube II., Ulterior, modelul de utilizare a substratului a evidențiat următoarele rezultate: creștere pe arginină, N2, xiloză, glucoză (aerobă), uree și citrat; nici o creștere pe glucoză (anaerobă), lactoză, zaharoză, indol, maltoză, manitol și fenilalanină; reacție indistinctă pentru lizină. Codul numeric obținut a dus la o clasificare la P. aeruginosa, indiferent de rezultatul reacției de lizină.caracterizarea taxonomică suplimentară a tulpinii AL98 a fost realizată prin analiza genei ARNr 16S. Gena aproape completă a fost secvențiată constând din 1530 nucleotide., Conform rezultatelor căutării bazei de date EMBL, secvența a evidențiat cele mai mari asemănări variind de la 99,9% la 100% la mai multe tulpini P. aeruginosa enumerate. Următoarele asemănări au fost de 98,7% cu Pseudomonas resinovorans și 97,7% cu Pseudomonas alcaligenes. Potrivit lui Moore și colab. Tulpinile de P. aeruginosa posedă un 32-bp regiune în 16S adnr, corespunzătoare E. coli poziții 66-103, care este hypervariable între diferite specii din genul Pseudomonas, dar 100% conservat printre tulpini de P. aeruginosa. Exact aceeași secvență, care este tipică pentru P., aeruginosa, a fost, de asemenea, determinată pentru tulpina AL98 la pozițiile 58-89. Datele secvenței genei ARNr 16S au fost transmise la baza de date a secvenței nucleotidelor EMBL și sunt enumerate la nr.accesiei. AJ249451. Tulpina AL98 a fost depus în cultura colecție de Institut für Mikrobiologie, Münster, Germania, ca P. aeruginosa AL98.

3.3 dezintegrarea cauciucului natural

culturile Pure de P. aeruginosa AL98 au fost obținute din plăci LB după mai multe pasaje pe acest mediu și testate pentru creștere pe concentratul de latex NR., Dezintegrarea vizibilă a cauciucului coagulat a început numai după 2-3 săptămâni de incubație. În schimb, când celulele AL98 din culturile de latex au fost folosite ca inocul, dezintegrarea materialului a început deja după 2 zile. Dacă aceste „celule adaptate” au fost ulterior supuse mai multor pasaje pe plăcile LB, s-a observat din nou un început întârziat al procesului de dezintegrare a cauciucului. S-a observat, în general, că creșterea a fost și mai întârziată cu cât au fost efectuate mai multe pasaje pe mediul LB. Observarea simultană prin microscopie luminoasă a relevat, în orice caz, un singur tip de tije motile., Cu toate acestea, celulele spălate din culturi adaptate au avut tendința, în general, de a adsorbi pe pereții cupelor Eppendorf sau a tuburilor de sticlă utilizate pentru spălare, spre deosebire de celulele din culturile LB, care erau identice microscopic cu celulele din cultura latexului, dar nu prezentau proprietăți adezive. Creșterea teste efectuate cu mai multe alte tulpini de P. aeruginosa din diferite colecții de cultură, cum ar fi PAO1, DSM 50071, DSM 939 și ATCC 27853, a arătat nicio creștere pe cauciuc natural și expuse chiar și o scădere în numărul de celule vii timpul de incubare pe medii care conțin cauciuc (datele nu sunt prezentate).

3.,4 Creștere pe cis-1,4-poliizopren

mai Multe IR conțin materiale au fost folosite ca unic sursele de carbon pentru a determina capacitatea și gradul de creștere a P. aeruginosa AL98 pe cauciucuri: NR-latex concentrat, care conține >90% greutate uscată de IR, NR mănuși de latex, care corespund vulcanizat NR, de exemplu, cu legături încrucișate între lanțurile de polimer, precum și prime sintetice IR. În toate cazurile, creșterea a fost determinată cu celule adaptate. Fig. 1a se referă la cursul de timp al mineralizării substraturilor de cauciuc., Pentru evaluarea emisiilor de CO2, s-a presupus că cauciucurile folosite constau în totalitate din carbon. După 6 săptămâni, cea mai bună mineralizare a fost detectată cu concentratul de latex NR (36%), urmată de mănușile de latex NR (26%) și IR (21%). În plus, au fost detectate și creșteri ale biomasei acelorași culturi pentru toate cele trei substraturi, așa cum se arată în Fig. 1B care arată cursul de timp al numărului de celule vii în timpul incubării pe aceste substraturi., În ciuda comportamentului de creștere preferențial adeziv, a apărut o creștere a numărului de celule suspendate în mediu în timpul cultivării cu concentrat de latex NR (de 35 de ori), mănușă de latex NR (de 11 ori), precum și IR (de șapte ori).

3.5 SEM și alte analize ale suprafețelor de cauciuc

comportamentul de colonizare și formarea biofilmului P. aeruginosa AL98 pe materialul mănușilor din latex NR au fost investigate prin sem (Fig . 2)., Comparativ cu un control neinoculat (Fig. 2A), suprafața cauciucului a fost acoperită complet de un biofilm după o perioadă de cultivare de 6 săptămâni (Fig. 2b). Fig. 2C prezintă celulele care fuzionează în materialul de cauciuc, care a avut loc după 2 săptămâni, în timp ce după 6 săptămâni de incubație dezintegrarea suplimentară a materialului a devenit vizibilă (Fig. 2D).