creșterea și întreținerea de microbi pe agar‐conțin mass-media în plăci Petri a fost mult timp o practică comună în microbiologie. În mod tradițional, metoda preferată pentru analiza cantitativă a populației culturilor pure și mixte se bazează pe placarea diluțiilor seriale și numărarea ulterioară a unităților Formatoare de colonii (CFU)., În ultimii ani, o serie de alternative, high-throughput (HT), metode bazate pe PCR cantitative (Neeley et al. 2005; Haarman and Knol 2006), fluorescent labelling (Blasco et al. 2003; Lay și colab. 2005) sau sondarea genomului cu micro-matrice (Bae et al . 2005) au câștigat popularitate (Liu et al. 2004a). Cu toate acestea, majoritatea acestor metode măsoară diferite entități, adică toate celulele, inclusiv celulele neviabile. Mai mult, aceste metode pot necesita utilizarea de echipamente speciale sau dezvoltarea extensivă a protocolului., În plus, unele dintre aceste metode sunt slab compatibile cu substraturi complexe și probe de mediu. Acest lucru explică în mare măsură de ce enumerarea microbilor prin numărarea coloniilor este încă o metodologie aplicată pe scară largă. În prezent, microbiologia se îndreaptă din ce în ce mai mult către analizele HT, care pot necesita utilizarea unor cantități mari de plăci. Acest lucru duce la dezavantaje grave atunci când se utilizează tehnici convenționale de placare și de numărare a coloniilor. Pregătirea mediilor și a plăcilor, precum și numărarea coloniilor necesită mult timp și necesită forță de muncă., În plus, volumele mari pot duce la costuri semnificative, în special atunci când se utilizează substraturi indicatoare sau reporter scumpe. În cele din urmă, multe metode consumă cantități mari de materiale, inclusiv consumabile, compromițând durabilitatea acestora. mai multe rapoarte descriu tehnologii alternative de placare în care volumele necesare sunt reduse (Jett et al. 1997; McNulty și Dunn 1999; Tornero și Dangl 2001; Hamilton și colab. 2002) sau procesul de numărare a coloniilor este automatizat (Marotz et al. 2001; Dahle și colab. 2004; Putman și colab. 2005)., Cu toate acestea, aceste exemple necesită echipamente care nu sunt prezente în laboratoarele de Microbiologie standard (Gilchrist et al. 1973; Liu și colab. 2004b), poate avea ca rezultat doar o scădere limitată (Gilchrist et al. 1973; Jett și colab. 1997; Hamilton și colab. 2002), sau sunt slab potrivite pentru automatizare (McNulty și Dunn 1999; Hamilton și colab. 2002). Bazându-ne pe această lucrare, raportăm o metodă simplă și flexibilă pentru determinarea numărului de celule care valorifică formatele plăcilor de microtitrare., Acesta integrează placarea miniaturizată rapidă și numărarea (semi‐) automată a minicoloniilor, permițând reducerea de 100 de ori a procesului în comparație cu procedurile convenționale de numărare CFU. Poate fi operat complet cu puțin mai mult decât o pipetă multicanal, o cameră digitală și ImageJ, un pachet de procesare a imaginii disponibil ca freeware (http://rsb.info.nih.gov/ij/). O serie de exemple sunt prezentate pentru a ilustra puterea abordării pentru evaluarea rapidă a numărului viabil de microorganisme industriale procariote și eucariote importante., pentru placare, am folosit diluții seriale de 10 ori care au fost preparate în plăci micro cu 96 de puțuri folosind o pipetă Genex Alpha cu 12 canale (Genex Labs, Torquay, UK). Pentru fiecare diluție, eșantioane de cinci µl au fost pipetate pe un mediu agar care conține plăci folosind aceeași pipetă. De obicei, s-au aplicat 60 până la 120 de picături pe placă pătrată de 12 cm. Plăcile au fost uscate la aer și apoi incubate până când coloniile au fost vizibile cu o dimensiune medie de 200-500 µm. Ulterior, aceste minicolonii au fost fotografiate cu o cameră digitală de înaltă rezoluție Canon EOS 350D (Canon 0020×665; Canon Inc.,, Japonia) echipat cu un obiectiv macro Sigma 105 mm (AF 105mm F2 * 8 ex MACRO F; Sigma Corporation, Japonia). Plăcile au fost așezate pe o suprafață neagră și iluminate din lateral pentru a obține un contrast mare între colonii și fundal.
imaginile digitale au fost prelucrate ulterior în ImageJ folosind un plug‐in nou dezvoltat care poate fi descărcat ca informații justificative. Procesul de numărare este reprezentat schematic în Fig. S1. Pe scurt, imaginile color au fost convertite în tonuri de gri pe 8 biți și inversate., Prin intervenție manuală folosind funcția „prag” a ImageJ; coloniile au fost selectate din fundal. Apoi toate imaginile au fost stivuite. După inversare, mediana a fost luată de la fiecare pixel cu pixelii vecini pentru reducerea zgomotului. Funcția „bazin hidrografic” a fost utilizată pentru a separa coloniile fuzionate, iar funcția „analiza particulelor” a fost utilizată pentru numărare. Ieșirea a fost salvată ca fișier text și ulterior procesată în Microsoft Excel., în studiul nostru, am urmărit în mod special dezvoltarea protocoalelor rapide de numărare a CFU pentru microbii industriali, inclusiv bacteriile cu acid lactic, Escherichia coli și Saccharomyces cerevisiae. Atunci când aceste tulpini sunt enumerate prin numărarea CFU convențională, de obicei între 30 și 300 de colonii pe vas standard de agar Petri de 8 cm în diametru, rezultă o numărare optimă. Un număr mai mare poate duce cu ușurință la subestimare, deoarece coloniile individuale nu pot fi discriminate., Numărul scăzut de colonii pe placă duce la abateri standard mari, care este rădăcina pătrată a mediei în distribuția Poisson. Acest lucru implică faptul că, în cazul în care sunt numărate cinci colonii, numărul de celule din probele placate este cuprins între 1 și 9 cu încredere de 95%, în timp ce pentru 100 de celule aceste valori sunt 80 și 120. În ultimul caz, intervalul de încredere de 95% este o abatere de 20% din media. Prin urmare, ne-am propus să dezvoltăm un protocol care să permită numărarea a cel puțin 100 de colonii., Acest lucru implică faptul că, în orice proces de reducere a numărului de plăci, este esențial să se mărească numărul de colonii care pot fi numărate pe cm2 de suprafață de agar. În experimentele noastre, acest lucru a fost realizat prin numărarea minicoloniilor cu o dimensiune de 200-500 µm. Prin urmare, coloniile au fost numărate de îndată ce minicoloniile sunt vizibile, ceea ce este mai devreme decât în mod normal se face cu numărarea convențională. Mai mult, creșterea multor colonii pe o suprafață relativ mică duce la colonii mai mici, de exemplu, datorită disponibilității limitate a substratului (Liu et al. 2004b)., Acest lucru crește în mod eficient numărul de colonii care pot fi numărate pe cm2 de suprafață agar. am folosit procedurile descrise mai sus pentru a efectua numărarea viabilă a diferitelor microorganisme industriale și am marcat aceste date la procedurile convenționale de numărare. Prin urmare, Streptococcus thermophilus CNRZ1066, Lactococcus lactis mg1363, Lact. plantarum WCFS1, E. coli DH5a și S. cerevisiae CBS57957 au fost cultivate în medii adecvate (Tabelul 1) pentru aproximativ 24 h la 37°C. Cultura diluții au fost pregătite în plăci cu 96 de godeuri în 12 ori și acestea au fost placat folosind ambele metode., Pentru metoda convențională, probele de 50 µl au fost pipetate pe o placă rotundă de agar cu diametrul de 8 cm cu un Gilson pipetman P100 și răspândite folosind un tampon de sticlă. Numărul mediu de CFU a fost comparabil, iar abaterile standard comparabile sau mai mici cu metoda minicolony care confirmă adecvarea metodei pentru numărarea rapidă a CFU. Din abaterile standard din tabelul 1, se poate concluziona că sensibilitatea metodei rapide este comparabilă cu metoda convențională, deși variația dintre numere poate diferi cu tipul de pipete utilizate, așa cum a susținut anterior Jett et al., (1997).
de exemplu, Lact. plantarum pete conțin minicolonies au fost în jurul valorii de 9 mm în diametru și, prin urmare, este posibil să numeri până la 200 de colonii per cm2 eficient pe DOAMNA‐galactoză agar, care este de obicei una sau două ordine de mărime mai mare decât convenționale de placare. Am constatat că dimensiunile petelor și minicoloniilor pot varia în funcție de tipul de mediu agar, timpul de uscare, matricea probei și speciile de interes (nu sunt arătate)., Poate afecta numărul de colonii care pot fi enumerate pe 5 µl spot, de obicei în intervalul cuprins între 10 și 150, dar nu și numărul de colonii care pot fi numărate pe cm2 pentru această anumită specie. Limita de detecție a metodei minicolonie este similară cu cea a metodei convenționale. Intervalul dinamic al noii metode a fost găsit egal cu metoda convențională (datele nu sunt prezentate). în ultimii ani, au fost dezvoltate alternative și variante HT pentru multe tehnici microbiologice convenționale., Cele mai bune exemple sunt, probabil, cultivarea loturilor lichide pentru care diverse alternative multi‐bine aparțin echipamentelor standard de laborator Acum o zi. De asemenea, sunt raportate mai multe alternative HT pentru numărarea CFU (Dahle et al. 2004; Liu și colab. 2004b; Putman și colab. 2005). Throughputs sunt crescute prin concentrarea fie pe automatizarea procesului de numărare, fie pe miniaturizarea placării în sine., Noutatea metodei raportate aici se bazează pe integrarea acestor aspecte, în timp ce necesită doar echipamente standard de laborator, o cameră digitală, software de imagistică disponibil ca freeware și un plug‐in dedicat care este disponibil ca Material suplimentar la această lucrare. Protocolul de placare rapidă și numărare rezultat este potrivit pentru o determinare rapidă a numărului de celule viabile. Metoda este foarte flexibilă, deoarece poate fi ușor implementată pentru diferite specii microbiene și este ușor de utilizat., Datorită miniaturizării sale, reduce cantitatea de materiale necesare cu aproximativ 100 de ori, ceea ce îl face o alternativă eficientă din punct de vedere al costurilor și al forței de muncă pentru metodele convenționale. Deoarece numărarea este parțial automatizată, utilizatorul poate monitoriza pașii critici în achiziția și procesarea datelor fără variabilitatea întâlnită din numărarea manuală a CFU (Lumley et al. 1997). Anticipăm că acest protocol este un instrument valoros pentru enumerarea de rutină a microbilor industriali în laboratoarele de cercetare și control al calității.
