Frecvența de CCR5 Delta-32 Mutație într-Virusul Imunodeficienței Umane (HIV)-seropozitivi HIV expuse Seronegative persoanelor Fizice și, în General, Populația din Medellin, Columbia

Francisco J Diaz, Jorge Vega, Paul J Patiño*, Gabriel Bedoya,
Jorge Nagles**, Cecilia Villegas**, Rodrigo Vesga***, Maria T Rugeles/+

Virusologie Laborator *Laborator de Imunologie, Departamentul de Microbiologie si Parazitologie, Facultatea de Medicină, Universitatea Antioquia, AA 1226, Medellin, Columbia **Institutul de Asigurări Sociale, Medellin, Columbia ***Institutul de Sănătate Metropolitane, Medellin, Columbia,

expunerea Repetată la virusul imunodeficienței umane (HIV) nu duce întotdeauna la seroconversie., Modificările coreceptorilor pentru intrarea HIV în celulele țintă sunt unul dintre factorii care blochează infecția. Am studiat frecvența mutației Delta – 32 în gena ccr5 în Medellin, Columbia. Două sute optsprezece indivizi distribuiți în trei grupuri diferite au fost analizați pentru mutația Delta-32 în gena ccr5 prin reacția în lanț a polimerazei (PCR): 29 seropozitivi HIV (SP), 39 seronegativi expuși (ESN) și 150 de indivizi ca eșantion de populație generală (GPS). Frecvența alelei mutante Delta – 32 a fost de 3,8% pentru ESN, 2,7% pentru GPS și 1,7% pentru SP., Doar un singur genotip mutant homozigot (Delta-32/Delta-32) a fost găsit printre ESN (2,6%). Genotipul heterozigot (CCR5 / Delta-32) a fost găsit în opt GPS (5,3%), într-un SP (3,4%) și într-un ESN (2,6%). Diferențele dintre frecvențele alelice și genotipice dintre cele trei grupuri nu au fost semnificative statistic. O comparație între frecvențele genotipice așteptate și cele observate a arătat că aceste frecvențe au fost semnificativ diferite pentru grupul ESN, ceea ce sugerează indirect un efect protector al genotipului mutant (Delta-32/Delta-32)., Deoarece acest genotip mutant a explicat rezistența infecției doar la una dintre persoanele noastre ESN, diferite mecanisme de protecție trebuie să joace un rol mai important în această populație.,

cuvinte Cheie: CCR5 – Delta-32 mutație – virusul imunodeficienței umane (HIV) – expus seronegative

de la începutul sindromul imunodeficienței dobândite (Sida) epidemii, s-a stabilit că activitatea sexuala cu parteneri multipli a fost principalul factor de risc de a dobândi virusul imunodeficienței umane (HIV) infecția cu dezvoltarea ulterioară a Sida., Cu toate acestea, există dovezi puternice care sugerează o rezistență naturală la infecție la mai multe persoane care au rămas neinfectate, în ciuda faptului că au avut mai multe expuneri la HIV, în special prin contact sexual (Paxton et al. 1996). Baza biologică pentru această rezistență abia începe să fie înțeleasă.

Pentru a intra în celula țintă HIV necesită prezența CD4 molecula care actioneaza ca receptor și de o a doua moleculă sau coreceptor, care în majoritatea cazurilor este un receptorilor chemokinici (Deng et al. 1996, Feng și colab. 1996)., Printre receptorii de chemokină, CCR5 și CXCR4 sunt principalii coreceptori pentru intrarea HIV.

Aproape simultan cu găsirea de HIV coreceptors, o mutație în gena care codifică pentru CCR5 molecula a fost descris, care conferă un grad ridicat de rezistență la infecția cu HIV in vitro și in vivo (Paxton et al. 1996, Liu și colab. 1996). Această mutație numită Delta-32 constă într-o ștergere a perechii de bază 32 care codifică o proteină nefuncțională și, ca rezultat, nu este exprimată în membrana celulară., Persoanele homozigote pentru această mutație nu au nicio modificare imunologică sau biologică cunoscută (Liu et al. 1996).

alela Delta – 32 este prezentă în principal în populația caucaziană (Liu et al. 1996, Martinson și colab. 1997, Magierowska și colab. 1998). În Statele Unite, frecvența este de 8% până la 10% în populația albă, dar mai mică de 1% în indivizii Afro-americani. Există, de asemenea, o frecvență foarte scăzută a mutației în rândul caucazienilor din Asia (Pakistan și India) și nu a fost raportată în China, Japonia sau populația pură Africană (Martinson et al. 1997)., În America Latină frecvențele au fost abia studiate. Nu a fost detectat în rândul persoanelor 32 din Venezuela și nici în grupurile amerindiene (Liu et al. 1996, Martinson și colab. 1997). În Columbia nu există rapoarte care să abordeze această problemă.

Din punct de vedere sexual expuși la HIV, dar seronegative persoane fizice (ESN), frecvența de Delta-32/Delta-32 genotip ajunge la 2,8% la 3,6%, ceea ce corespunde la două la trei ori frecvența găsit în Caucaz non-populație expusă (Dean et al. 1996, Huang și colab. 1996)., Această frecvență poate ajunge până la 33% la persoanele cu risc mai mare de infecție (Huang et al. 1996). În schimb, persoanele infectate cu HIV prezintă frecvența mai mică a alelei Delta-32. S-a considerat că indivizii cu genotip mutant homozigot (Delta-32/Delta-32) au fost 100% rezistenți la infecția cu HIV, cel puțin cu tulpini tropice M, care utilizează molecula CCR5 ca coreceptor. Cu toate acestea, recent au existat rapoarte de infecție cu HIV la două persoane care sunt homozigote pentru alela mutantă (Delta-32 / Delta-32) (Biti et al. 1997)., Aceste infecții ar fi putut apărea cu tulpini tropice T care utilizează molecula CXCR4 ca coreceptor pentru a intra în celulele țintă.

a fost dificil de stabilit dacă genotipul CCR5/Delta-32 conferă orice grad de rezistență la infecții. Studiile asupra acestui aspect sunt contradictorii (Samson et al. 1996, Dean și colab. 1996, Huang și colab. 1996, Hoffman și colab. 1997).,

Din literatura de specialitate se poate concluziona că Delta-32/Delta-32 genotip conferă un grad ridicat de protecție a infecției cu HIV, dar nu este principalul factor asociat cu rezistență, deoarece majoritatea ESN lipsa acestui factor genetic. Diferite mecanisme, cum ar fi alte mutații coreceptoare sau factori imunologici, ar putea explica lipsa infecțiilor în acest grup cu risc ridicat.,

acest studiu a fost realizat pentru a estima frecvența alelei Delta-32 și genotipurile pentru gena ccr5 în diferite subgrupuri: ESN, populația seropozitivă și generală pentru a explora influența acestui factor genetic în comportamentul infecției cu HIV în țara noastră.,

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

MATERIALS AND METHODS

Population -The study was carried out in three groups of individuals., ESN: persoane cu antecedente de relații sexuale repetate fără protecție cu subiecți infectați cu HIV. Numărul de subiecți din acest grup este aproape de universul cunoscut ESN în orașul nostru; SP: toate persoanele incluse în acest grup au fost parteneri sexuali de ESNs care au avut anticorpi anti-HIV și unele dintre ele, de asemenea, a prezentat semne clinice de infecție HIV; GPS: această populație a fost de voluntari adulți, cei mai mulți dintre ei studenți și muncitori din instituția noastră sau instituțiile de sănătate legate de universitatea noastră. Niciuna dintre ele nu a fost selectată pe baza riscului de infecție cu HIV., Statutul serologic HIV pentru persoanele din acest grup nu a fost determinat.

statutul Serologic – La statutul serologic pentru persoane fizice în ESN grup a fost confirmat printr-un test ELISA (Enzygnost HIV-1+2 Plus, Behring Diagnosticare, Margurg, Germania).

determinarea genotipului – determinarea genotipului a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Michael et al. 1997). Pe scurt, s-a recoltat o probă de sânge periferic cu EDTA ca anticoagulant. Celulele mononucleare au fost separate prin Gradient Ficoll-Hipaque., O parte din celule a fost crioconservată pentru studii funcționale viitoare. Celulele rămase au fost utilizate pentru extracția ADN folosind tehnica fenol-cloroform. Specifice segment de gena ccr5 a fost amplificat prin reacția în lanț a polimerazei (PCR), folosind următoarele primeri: CCR5-Delta1 (5′-ACCAGATCTCAAAAAGAAGGT CT-3′) și CCR5-Delta-2 (5′-CATGATGGTGAAG ATAAGCCTCACA-3′). Reacția conținea 5 pmol din fiecare primer, 0,3 unități de ADN polimerază Taq (Perkin-Elmer), 2 mM de MgCl2 și 200 µM din fiecare dNTP într-un volum final de 25 µl., Reacția a fost supusă la 30 de cicluri de amplificare cu trei temperaturi 96°C x 15 sec, 58°C x 60 sec și 72°C x 60 sec. Rezultatul de amplificare a fost electrophoresed într-un 2% gel de agaroză, colorate cu bromură de etidiu și vizualizate în cadrul U. V. transiluminare. Pentru genotipul sălbatic (CCR5/CCR5), produsul PCR a fost de 225 bp, în timp ce un produs de 193 bp a indicat un homozigot mutant (Delta-32 / Delta-32). Prezența ambelor benzi a indicat un genotip heterozigot (CCR5 / Delta-32) (figura).,

analiza statistică – frecvențele alelice și genotipice găsite au fost comparate și diferențele evaluate folosind testul chi pătrat (chi2). Diferențele dintre frecvențele așteptate și cele observate ale genotipurilor au fost evaluate prin același test.

REZULTATE

Am studiat 218 persoane împărțite în trei grupe: ESN, SP și GPS. Distribuția și profilul lor demografic sunt prezentate în tabelul I. toate grupurile au avut o medie de vârstă similară., Grupurile GPS și ESN au avut o distribuție similară a genului, dar diferită de grupul SP în care predomină bărbații. Majoritatea cuplurilor erau heterosexuale și puțini dintre ei erau homosexuali sau indivizi care nu aveau preferințe bisexuale. Toți subiecții seropozitivi au dobândit infecția prin contact sexual.

frecvențele genotipului sunt prezentate în tabelul II. cea mai mare frecvență a fost pentru genotipul sălbatic (ccr5+ / ccr5). Genotipul heterozigot (CCR5+/Delta-32) a fost găsit în opt GPS, într-un SP și într-un ESN., Doar un singur genotip mutant homozigot (Delta-32/Delta-32) a fost găsit printre ESN (figura). Diferența de frecvență dintre cele trei grupuri studiate nu a fost semnificativă statistic. Frecvențele alelice pentru CCR5 și Delta-32 sunt prezentate în tabelul III. frecvența alelei mutante Delta-32 a fost de 3,8% pentru ESN, 2,7% pentru GPS și 1,7% pentru SP. Diferențele nu au fost semnificative statistic.

pe Baza frecvențelor alelice ale fiecărui grup este posibil să se prevadă genotip frecvență având în vedere că acestea urmează echilibru Hardy-Weinberg., Asta înseamnă că frecvențele au o distribuție binomială în conformitate cu următoarea ecuație: p2 + 2pq + q2 = 1, unde p și q sunt frecvențele alelice de ccr5+ și Delta-32, respectiv, și p2, 2pq și q2 sunt genotip frecvențe de ccr5+/ccr5+, ccr5+/Delta-32 Delta y-32/Delta-32, respectiv. O comparație între frecvențele genotipice așteptate și cele observate este prezentată în tabelul IV., În SP și GPS frecvențele observate sunt similare cu cele așteptate, în timp ce în ESN grup frecvenței observate diferă în mod semnificativ de frecvența așteptată obtinerea departe de echilibrul Hardy-Weinberg (p<0.0005).

Deoarece numărul de persoane în ESN grup și frecvența de Delta-32 au fost reduse, nu a fost posibil să se stabilească o relație între ccr5 genotip și unele comportamente de risc, cum ar fi frecvența de utilizare a prezervativului, tip de relație sexuală, și timp de expunere., Singura persoană cu un genotip homozigot mutant a fost o femeie care a avut o relație sexuală stabilă timp de trei ani, cu o medie de opt relații sexuale neprotejate pe lună cu soțul ei infectat. Subiectul cu genotip heterozigot găsit în acest grup corespunde unui bărbat Bisexual promiscuu care a avut frecvent relații sexuale anale timp de șapte luni cu un cuplu infectat.,

DISCUȚII

componența etnică a Columbian populației este un produs de amestecul de Europeni, Africani și Indieni. Contribuția Europei este în principal spaniolă (Bravo et al. 1996). Două rapoarte de frecvență Delta – 32 în populația spaniolă au arătat o frecvență a alelei de 8,6% (IÎ 95% 4,9-12,3%) la basci, 8,2% (IÎ 95% 5,4-10,9%) la catalani și 5% (IÎ 95% 2,0-8,0%) la indivizii din San Sebastian (Martinson et al. 1997, Magierowska și colab. 1998).,

în studiul nostru frecvența Delta-32 pentru grupul GPS a fost de 2,7% (95% CI 0,90 – 4,5%). Pe baza acestui rezultat am putea calcula că componenta spaniolă a GPS – ului este aproape sau chiar mai mică de 50%. Această estimare este diferită de un raport anterior realizat de Bravo et al. (1996), în care folosind un grup de markeri genetici diferiți au observat o prevalență a componentei europene asupra celorlalte rase din populația din provincia noastră (Antioquia)., Deoarece eșantionul GPS nu a inclus doar persoane născute în Antioquia, ci și rezidenți ai acestei provincii, este posibil ca un număr semnificativ de persoane incluse în acest grup să se fi născut în diferite provincii unde influența rasei europene nu este cunoscută. Acest fapt ar putea explica prevalența scăzută observată a Delta-32.

Deși acest studiu a constatat o prevalență mai mare de Delta-32 alele și Delta-32/Delta-32 genotip printre ESN, diferențele dintre frecvențele nu au fost semnificative (Tabelele II, III)., Probabil dimensiunea redusă a eșantionului nu a permis să se arate o asociere semnificativă între genotip și infecție.

În absența pozitive și negative de selecție sau de alți factori, cum ar fi frecvente recente de migrație, de înaltă mutatii rată sau indice ridicat de endogamia, distribuția genotipurilor în fiecare grup trebuie să fie similară cu valorile estimate în urma Hardy-Weinberg distribuție. GPS-ul a prezentat o distribuție genotipică în echilibru., Deoarece circulația HIV este un factor de selecție, acest fapt ar putea avea două explicații: frecvența genotipului Protector Delta-32/Delta-32 este prea mică pentru a fi perceptibilă sau gradul de expunere la HIV este încă scăzut în această populație. Cunoscând frecvența alelei Delta – 32, am calculat frecvența genotipului Delta-32/Delta-32 ca 0,00071. Aceasta înseamnă că o singură persoană din 1406 indivizi ar purta genotipul homozigot mutant (Delta-32/Delta-32).

distribuția genotipurilor în SP este, de asemenea, în funcție de echilibrul Hardy-Weinberg., Explicația acestui fapt în acest grup este mai dificilă, deoarece toți indivizii au fost expuși Sexual la HIV și acest lucru trebuie să fi selectat pozitiv genotipul sălbatic CCR5+/ccr5+. Este posibil ca evoluția rapidă la SIDA și moartea indivizilor care poartă genotipuri sălbatice peste heterozigot ar putea compensa acest efect, dar din nou frecvența scăzută a alelei Delta-32 face dificilă analiza.,

lipsa de echilibru în frecvențele genotipice în rândul ESN a fost foarte semnificativă datorită prezenței unui individ cu genotipul Delta-32 / Delta-32. Acest lucru face ca frecvența de 17 ori mai mare decât se aștepta (tabelul IV). Această constatare este greu explicată de unul dintre următoarele argumente care pot contribui, de asemenea, la ruperea echilibrului Hardy-Weinberg într-o populație: imigrația europeană recentă și endogamia, deoarece aceste fapte nu se găsesc frecvent în rândul populației noastre. Rata mutațională pentru această mutație nu trebuie să fie ridicată., Posibilitatea ca această distribuție să fi avut loc aleatoriu este, de asemenea, foarte scăzută (p<0.0005). Selecția pozitivă a persoanelor cu astfel de genotip Delta-32 / Delta-32 printre ESN este cea mai plauzibilă explicație pentru lipsa de echilibru. Prin urmare, efectul protector al acestui genotip a fost arătat, deși indirect.

În studiul nostru, frecvența Delta-32/Delta-32 genotip doar explică rezistența la infecții într-un procent foarte mic de ESN persoane (2.6%)., Acest lucru este în concordanță cu alte studii care au arătat rezultate similare (Bernard et al. 1999). Deoarece multe dintre persoanele din grupul ESN au avut un grad ridicat de expunere la HIV, trebuie să existe și alte mecanisme responsabile pentru această „protecție naturală”. Recent, s-a demonstrat că virusul HIV ar putea folosi alte receptori chemokinici cum ar fi CCR2 și CCR3 ca correceptors (Berger et al. 1999). Prin urmare, mutațiile în aceste molecule sau în liganzii receptorilor de chemokină ar putea explica rezistența la infecția cu HIV a unor indivizi., Cu toate acestea, mutația CCR2-64I, nu a fost asociată cu un fenotip rezistent la ci, mai degrabă, cu o întârziere în evoluția bolii (Smith et al. 1997). În mod similar, polimorfismul SDF-1-3 ‘ a raportat în alfa-chemokina SDF-1 a fost asociat cu întârzierea apariției simptomelor legate de SIDA (Winkler et al. 1998). Alte gene ale sistemului imunitar, cum ar fi cele ale sistemului HLA, par să influențeze, de asemenea, progresia bolii, deși efectele sunt complexe și pot depinde de interacțiunile cu alte gene gazdă (McNicholl et al. 1997)., Răspunsurile imune celulare specifice, mediate în special de celulele T citotoxice sau de răspunsurile umorale la nivelul mucoasei, au fost demonstrate la persoanele seronegative expuse (Mazzoli et al. 1997), indicând faptul că imunitatea dobândită ar putea fi mecanismul responsabil pentru controlul infecției la acești indivizi. Importanța relativă a acestor mecanisme în populații cu diferite moduri de expunere sau fond genetic trebuie să fie elucidat

• Berger EA, Murphy PM, Farber JM 1999., Receptorii chemokinei ca coreceptori HIV-1: roluri în intrarea virală, tropism și boală. Annu Rev Immunol 17: 657-700.
• Bernard n, YANNAKIS CM, Lee JS, TSOUKAS CM 1999. Activitatea limfocitelor T citotoxice specifice virusului imunodeficienței umane (HIV) la persoanele seronegative expuse la HIV. J Infect Dis 179: 538-547.
• Biti R, Franceză R, Young J, Bennetts B, Stewart G 1997. Infecția cu HIV-1 la un homozigot individual pentru alela de ștergere CCR5. Medicina Naturii 3: 252-253.
• Bravo ML, Valenzuela CY, Arcos-Burgos OM 1996., Polimorfismul și relațiile fitetice ale comunității Paisa din Antioquia (Columbia). Geografia Genelor 10: 11-17.
• Dean M, Carrington M, Winkler C, Huttley G, Smith M, Allikmets R, Goedert J, Buchbinder SP, Vittinghoff E, Gomperts E, Donfield S, Vlahov D, Kaslow R, Într-Un, Rinaldo C, Detels R 1996. Restricție genetică a infecției cu HIV-1 și progresia la SIDA printr-o alelă de ștergere a genei structurale CCR5. Știință 273: 1856-1862.,
• Deng H, Liu R, Ellmeier W, Choe S, Unutmaz D, Burkhart M, Di Marzio P, Marmon S, Sutton RE, Dealul M, Davis C, Peiper S, Schall TJ, Littman DR. Landau N 1996. Identificarea unui co-receptor major pentru izolatele primare de HIV-1. Natură 381: 661-666.
• Feng Y, Broder CC, Kennedy pe, Berger EA 1996. Cofactor de intrare HIV-1: clonarea funcțională a ADNc a unui receptor cuplat g cu șapte transmembrane. Știință 272: 872-877.
• Hoffman TL, MacGregor RR, Burger H, Mick R, Doms RW, Collman RG 1997., Genotipurile CCR5 în Cuplurile active sexual discordante pentru starea infecțioasă a virusului imunodeficienței umane de tip 1. J Infect Dis 176: 1093-1096.
• Huang Y, Paxton WA, Wolinsky SM, Neumann AU, Zhang L, A T, Kang S, Ceradini D, Jin Z, Yazdanbakhsh K, Kunstman K, Erickson D, Dragon E, Landau NR, Solesbee J, Ho DD, Koup RA 1996. Rolul unei alele mutante CCR5 în transmiterea HIV-1 și progresia bolii. Medicina Naturii 2: 1240-1243.
• Liu R, Paxton WA, Choe S, Ceradini D, Martin SR, Horuk R, MacDonald MINE, Stuhlmann H, Koup RA, Landau NR 1996., Defect homozigot în CORECEPTORUL HIV-1 reprezintă rezistența unor indivizi expuși la infecția cu HIV-1. Celula 86: 367-377.
• Magierowska M, Lepage V, Boubnova L, Carcassi C, De Juan D, Djoujah S, El Chenawi F, Grunnet N, Halle L, Ivanova R., Jungerman M, Naumovaa E, Petrany G, Sonnerborg O, Ami C, Thorsby E, Vu-Trieu O, Debre P, Theodorou eu, Cgarron D 1998. Distribuția genei CCR5 32 deleția perechii de bază și a variantei SDF1-3 ‘ A la indivizi sănătoși din diferite populații. Imunogenetica 48: 417-419.,
• Martinson JJ, Chapman NH, Rees DC, Liu YT, Clegg JB 1997. Distribuția globală a genei CCR5 32-ștergerea basepair. Genetica Naturii 16: 100-103.
• Mazzoli S, Trabattoni D, Lo Caputo s, Piconi S, Ble C, Meacci F, Ruzzante S, Salvi-O, Simplu F, Longhi R, Fusi ML, Tofani N, Biasin M, Villa ML, Mazzota F, Clerici M 1997. Imunitatea mucoasă și celulară specifică HIV la partenerii seronegativi HIV ai persoanelor seropozitive HIV. Medicina Naturii 3: 1250-1257.
• McNicholl JM, Smith DK, Qari SH, Hodge t 1997., Genele gazdă și HIV: rolul genei receptorului de chemokină CCR5 și alela sa (Delta-32 CCR5). Bolile Infecțioase Emergente 3: 261-271.
• Michael NL, Chang G, Louie LG, Hives JR, Dondero D, Birx DL, Sheppard HW 1997. Rolul fenotipului viral și al defectelor genei CCR-5 în transmiterea HIV-1 și progresia bolii. Nat Med 3: 338-340.
• Paxton AW, Martin SR,Tse D, O ‘ brien TR, Skurnick J, VanDevanter NL, Padian N, Braun RD, Kotler DP, Wolinsky SM, Koup RA 1996., Rezistența relativă la infecția cu HIV-1 a limfocitelor CD4 de la persoanele care rămân neinfectate în ciuda expunerilor sexuale multiple cu risc ridicat. Nat Med 2: 412 – 417.
• Samson M, Libert F, Doranz BJ, Rucker J, Liesnard C, Farber CM, Saragosti S, Lapouméroulie C, Cognaux J, Forceille C, Muyidermans G, Verhofstede C, Burtonboy G, Georges M, Imai T, Rana S, Yi Y, Smyth RJ, Collman RG, Doms RW, Vassart G, Parmentier M 1996. Rezistența la infecția cu HIV-1 la indivizii caucazieni care poartă alele mutante ale genei receptorului CHEMOKINEI CCR-5. Natură 382: 722-725.,
• Smith MW, Dean M, Carrington M, Winkler C, Huttley GA, Lomb DA, Goedert JJ, O ‘ brien TR, Jacobson LP, Kaslow R, Buchbinder S, Vittinghoff E, Vlahov D, Hoots K, Hilgartner MW 1997. Influența genetică contrastantă a variantelor CCR2 și CCR5 asupra infecției cu HIV-1 și a progresiei bolii. Știință 277: 959-965.
• Winkler C, Modi W, Smith MW, Honjo T, Tashiro K, Yabe D, Buchbinder S, Vittinghoff E, Goedert JJ, O ‘brien TR, Jacobson LP, Detels R, Donfield S, Willoughby O, Gomperts E, Vlahov D, Solesbee J, O’ brien SJ 1998., Restricția genetică a patogenezei SIDA printr-o variantă a genei CHEMOKINEI SDF-1. Știință 279: 389-393.

Fig. Tabelul | I | Tabelul II | III | Tabelul IV

Această lucrare a beneficiat de suport financiar de la Universitatea Antioquia și Banco de la Republica.

+autor corespondent. Fax : + 57-4 510 6062. E-mail: [email protected].,co

Received 26 August 1999

Accepted 4 January 2000