Dezvoltarea testelor: 5 considerații și 8 Fundamente

capacitatea de a proiecta, construi și rula teste specifice, sensibile și robuste este crucială în toate domeniile cercetării biomedicale. Cu titlu de exemplu, în aplicațiile de cercetare de bază poate fi necesar să se cuantifice nivelurile celulare ale unei anumite proteine, să se determine nivelurile unui metabolit în ser sau urină sau, poate, să se compare activitatea catalitică a unei enzime în țesutul normal și bolnav ., În industria farmaceutică și biotehnologie sunt necesare teste pentru identificarea și caracterizarea potențialelor noi molecule de medicament . Alte studii pot necesita măsurarea cantitativă a nivelurilor de expresie a genelor . indiferent de aplicația specifică sau de molecula particulară care trebuie măsurată, trebuie luați în considerare o serie de factori fundamentali atunci când se dezvoltă un test biologic., Este important să se acorde o atenție deosebită nu doar testului în sine, ci și întregului flux de lucru care trebuie dezvoltat de la pregătirea eșantionului până la analiza calității datelor furnizate de test. Aspectele cheie ale dezvoltării analizei discutate în acest articol sunt de aplicabilitate generală. Acestea sunt valabile indiferent de tipul de test care urmează să fie elaborat (de ex.,, teste pe bază de anticorpi, cum ar fi ELISA și electrochemiluminescența, determinarea concentrației totale de proteine/proteine, teste de activitate enzimatică, teste pe bază de celule sau PCR cantitativ sau teste specializate, cum ar fi testul de activare cu o singură moleculă ). În mod similar, aspectele cheie sunt valabile indiferent de sistemul de detecție utilizat, fie că se bazează pe absorbție, fluorescență, radioactivitate sau chiar spectrometrie de masă., Fiecare test specific va avea propriile sale idiosincrazii, dar acordând o atenție deosebită punctelor discutate mai jos, cercetătorul poate contribui la asigurarea faptului că dezvoltă un test robust, fiabil și adecvat scopului. Adesea, există orientări și / sau discuții ample despre dezvoltarea testelor folosind tehnologii specifice, cum ar fi cele pentru spectrometria de masă a măsurătorilor peptidelor vizate . Deși se concentrează asupra aspectelor specifice ale testelor specifice ale statelor membre, o serie de puncte de discuție sunt relevante pentru orice proiect de dezvoltare a testelor., În special, autorii subliniază necesitatea de a adopta o abordare adecvată pentru dezvoltarea și validarea testelor . Testele complexe pe bază de celule care urmăresc să imite mediul celular in vivo joacă un rol din ce în ce mai mare în descoperirea și dezvoltarea medicamentelor. În timp ce detaliile specifice ale acestor teste depășesc domeniul de aplicare al acestui articol, este important să subliniem faptul că principiile de bază ale dezvoltării testelor trebuie respectate pentru a construi teste robuste și fiabile care generează date semnificative .,

kiturile de dezvoltare a testelor comerciale sunt disponibile pentru a ușura unitatea de testare. De exemplu, Stadtmauer EA și colab utilizat DuoSet Auxiliare Reactiv Kit de R&D Sisteme de a stabili o ELISA detectează reziduale Cas9 proteine în CRISPR-inginerie T celule . Organizațiile comerciale au dezvoltat o gamă largă de teste și ar trebui mai întâi explorate înainte de a întreprinde efortul de a dezvolta un nou test. Testele de probă includ testul MILLIPLEX MAP maus angiogenesis magnetic bead-based din MilliporeSigma .,

când se angajează într-un proiect de dezvoltare a testului, cercetătorul ar trebui să pună o serie de întrebări pentru a defini cerințele exacte ale testului.

punctul de plecare este să fie absolut clar cu privire la ce moleculă și exact ce proprietate a acelei molecule trebuie măsurată. Acest lucru poate părea evident, dar este o chestiune de importanță fundamentală și stă la baza tuturor activităților ulterioare de dezvoltare a testelor. De exemplu, cercetătorul dorește să măsoare cantitatea totală a unei anumite proteine dintr-un lizat celular sau numai forma fosforilată sau atât proteina totală, cât și cea fosforilată ?, În mod similar, studiul poate dicta că izoformele specifice sau variantele de îmbinare ale proteinei de interes trebuie măsurate . În cazul unei proteine, trebuie să fie clar dacă parametrul cheie de măsurat este cantitatea de proteină prezentă sau funcția sa biologică, cum ar fi activitatea enzimatică sau efectul unei citokine asupra potențialelor ținte celulare. Alternativ, poate fi acceptabil sau de dorit să se măsoare nivelul expresiei genelor la nivelul ARNm., Este posibil ca studiul să dicteze dezvoltarea unor teste separate pentru a măsura expresia genelor, nivelurile de proteine la starea de echilibru și, respectiv, funcția biologică ; fiecare test va genera informații diferite, dar complementare despre molecula de interes.

este important să se ia în considerare sursa moleculei care urmează să fie testată. Molecula trebuie măsurată într-un fluid corporal, cum ar fi serul sau urina? Molecula trebuie măsurată într-un organ obținut de la un animal experimental sau o probă de biopsie de la un pacient?, Poate că materialul sursă va fi țesutul post-mortem. Este posibil ca sursa să fie celule cultivate in vitro, caz în care un aspect important este dacă acestea vor fi celule primare rare sau o linie celulară imortalizată ușor scalabilă. sursa moleculei va determina cantitatea și disponibilitatea eșantionului. De asemenea, va determina concentrația moleculei de interes și poate influența profund stabilitatea acesteia, așa cum se discută în secțiunile următoare., Astfel, sursa moleculei de interes este probabil să aibă o influență semnificativă asupra fluxului general de analiză care este dezvoltat în cele din urmă.de asemenea, este important să se înțeleagă stabilitatea moleculei pentru care urmează să fie dezvoltat testul. Este relativ stabilă sau este extrem de instabilă, necesitând precauții speciale în timpul colectării și pregătirii eșantionului pentru analiză pentru a obține date semnificative de analiză?, Chiar și moleculele care sunt stabile în forma izolată pot fi instabile în mediul biologic complex al probelor care urmează să fie analizate, unde pot fi supuse oxidării, proteolizei sau pierderii modificărilor post-translaționale. De exemplu, poate fi necesară includerea agenților reducători sau a inhibitorilor de protează și/sau fosfatază în tampoanele de probă pentru a menține moleculele în formele lor relevante din punct de vedere fiziologic, atât în timpul preparării probei, cât și pe parcursul testului în sine., Sursa moleculei este un aspect important aici; o moleculă care este stabilă în ser, să zicem, se poate dovedi extrem de instabilă într-un omogenat hepatic. În cazul testării biopsiei sau a țesutului post-mortem, este important să se cunoască modul în care țesutul a fost manipulat și depozitat, deoarece acest lucru poate afecta profund atât cantitatea, cât și calitatea anumitor molecule.,în scopul de a dezvolta un test care este apt-pentru-scop, este important să se decidă de la început dacă o măsurare semi-cantitativă a moleculei, cum ar fi Western blot, îndeplinește cerințele proiectului sau dacă este necesar un test riguros cantitativ.

de asemenea, este important să se ia în considerare câte probe vor trebui analizate. Dacă doar o mână de probe vor fi testate, atunci un format manual de testare manuală în mai multe etape intensiv de muncă poate fi perfect acceptabil., În schimb, dacă se vor executa mii sau zeci de mii de teste, poate ca parte a unui exercițiu de profilare compusă, va fi important să simplificați, să eficientizați și să automatizați procesul de testare atât cât permit resursele de laborator, cu, de exemplu, un format precum microarray. Cu toate acestea, matrice aduce propriul set de probleme, cum ar fi variația spațială intra-test .,

răspunsurile la toate aceste întrebări referitoare la molecula care urmează să fie analizată vor juca un rol cheie în a ajuta cercetătorul să decidă formatul cel mai potrivit pentru nevoile lor particulare și ar trebui să fie luate în considerare atunci când se analizează fundamentele analizei discutate în secțiunea următoare.având în vedere aceste întrebări cu privire la molecula care urmează să fie testată, trebuie acordată o atenție deosebită unui număr de probleme tehnice/practice fundamentale care se aplică indiferent de molecula particulară de interes sau de formatul specific de testare adoptat.,

o considerație absolut esențială este Specificitatea testului. După ce a decis exact ce moleculă și parametru al acelei molecule trebuie măsurat, cercetătorul trebuie să stabilească că testul va măsura doar ceea ce doresc să măsoare și nu orice altceva., Dacă se constată că testul măsoară atât molecula dorită, cât și alte molecule, atunci este posibil să se ia măsuri pentru a îmbunătăți Specificitatea testului. trebuie luate în considerare două aspecte suprapuse ale specificității testului.

• În primul rând, reactivii de detecție primară sunt specifici în mod corespunzător? De exemplu, în cazul testului bazat pe HPLC, cât de încrezător este cercetătorul că un vârf identificat la un anumit timp de retenție este molecula de interes și nu o moleculă diferită care se întâmplă doar să coelute cu molecula de interes., Aici trebuie luată în considerare sursa analitului. Analiza probelor de urină poate să nu dea naștere la vârfuri care coeluează cu molecula de interes. Cu toate acestea, este posibil ca același lucru să nu fie valabil pentru probele de omogenat seric sau tisular analizate în cadrul aceluiași test. Într-un test pe bază de anticorpi, anticorpul utilizat este absolut specific pentru proteina țintă sau reacționează încrucișat și cu alte proteine?, Este posibil să se obțină anticorpi specifici pentru o anumită proteină sau o anumită modificare post-translațională, cum ar fi fosforilarea la un anumit situs sau la un neo-epitop generat la scindarea de către o proteinază . Destul de des, se dorește un anticorp cu afinitate mai mare . Acești reactivi de anticorpi trebuie să fie caracterizați riguros în condițiile reale de testare pentru a se asigura că au specificitatea dorită, reacționând numai cu produsul dorit și nu cu molecula de substrat/precursor., În testele care nu utilizează detectarea anticorpilor, cum ar fi un test de clivaj peptidic fluorogenic, gradul de specificitate va fi mult mai mic. În loc de clivaj la un anumit site generatoare de un semnal, clivaj la orice site-ul în peptida va da acum naștere la un semnal.
• acest lucru ne aduce la al doilea aspect al specificității testului și este o problemă specială pentru testele enzimatice in vitro., Chiar dacă detectarea reactivi sunt specifice pentru un anumit eveniment se dorește a testului, acesta poate fi bine că într-un brut de celule sau țesut lizat omogenat că mai multe enzime sunt capabile de a efectua același eveniment (de exemplu, fosforilare, proteolitice clivaj sau alte post-translaționale modificare). Această problemă va fi chiar mai mare pentru testul de clivaj peptidic fluorogenic dat mai sus., Problema activităților multiple care se suprapun în lizatele brute poate fi adesea depășită prin includerea unei etape suplimentare de preparare a probei, cum ar fi o imuno-Precipitare specifică, pentru a obține Specificitatea testului dorit . Alternativ, în funcție de natura studiului, cea mai bună soluție poate fi efectuarea testului de activitate utilizând o enzimă înalt purificată (nativă sau recombinantă).

cât de sensibil trebuie să fie testul? Acest lucru va fi determinat atât de nivelurile moleculei de interes din eșantion, cât și de volumul probei disponibile., Punctul important este că testul trebuie să fie suficient de sensibil, astfel încât nivelul moleculei să se încadreze bine în intervalul dinamic al testului (vezi mai jos). Acesta este un aspect important atunci când se decide asupra formatului de testare și a sistemului de detectare. Dacă este necesară o mare sensibilitate, atunci o fluorescență, mai degrabă decât o absorbție, citirea este mai probabil să dea sensibilitatea dorită. Sensibilitatea poate fi, de asemenea, crescută prin utilizarea amplificării enzimatice a semnalului original ., Astfel de sisteme de testare „cuplate” pot fi extrem de sensibile, dar oferă, de asemenea, o oportunitate sporită pentru ca proba de testare să interfereze cu testul (a se vedea mai jos).

este important să se determine intervalul dinamic al testului. Cu alte cuvinte, intervalul în care citirea testului este proporțională cu cantitatea de moleculă țintă din proba analizată., În cazul unui test de măsurare a concentrației unei molecule, este important ca testul (indiferent de formatul adoptat) să fie calibrat corespunzător prin construirea unei curbe de calibrare adecvate, cum ar fi exemplul ipotetic din Figura 1. În mod similar, în cazul unui test enzimatic, trebuie să se asigure că testul funcționează într-un interval astfel încât viteza inițială a reacției să fie măsurată și că viteza măsurată este proporțională cu cantitatea de enzimă adăugată la test., Pentru a rămâne în intervalul dinamic al testului (unele) probe pot fi diluate sau concentrate. Aceasta poate fi o problemă specială dacă molecula de interes este prezentă la niveluri foarte diferite în diferite probe. Nerespectarea intervalului dinamic al testului va duce la generarea de date false. Intervalele dinamice trebuie, de asemenea , testate in vivo, dacă testul urmează să fie utilizat in vivo, de exemplu, folosind linii celulare care exprimă o țintă de anticorpi la diferite niveluri pentru dezvoltarea unui test IHC .,

Figura 1. Calibrare test / interval dinamic.

la proiectarea unui test, este important să se ia în considerare factorii care pot interfera cu citirea testului care conduc la rezultate eronate. Problema specificității testului este discutată mai sus. Aici discutăm alți factori care pot interfera cu citirea testului.

în cazul unei citiri fluorescente, este important să se asigure că eșantionul care urmează să fie analizat nu stinge citirea fluorescentă., Aceasta poate fi o problemă specială în cazul testelor care utilizează lizați de celule brute sau omogenați de țesuturi. În mod similar, în testele enzimatice sau celulare fluorogene utilizate în scopuri de screening/profilare a compușilor, cercetătorul trebuie să se asigure, în măsura în care este posibil, că compușii testați nu pot stinge citirea fluorescentă. Astfel de compuși ar afișa o activitate inhibitoare puternică aparentă, în timp ce nu au un efect inhibitor direct asupra țintei dorite. Unii compuși pot ei înșiși fluoresce, dând astfel un semnal de test fals., O astfel de interferență a compusului poate fi redusă prin utilizarea reporterilor fluorescenți care excită și emit la lungimi de undă mai lungi . O altă problemă comună este interferența componentelor eșantionului, cum ar fi agenții reducători sau detergenții cu unele dintre testele populare de proteine.

în testele cuplate enzimatic (fie că sunt teste ale activității enzimatice sau ale metaboliților) este esențial să se determine că enzimele cuplante nu măsoară din neatenție o componentă a probei, alta decât molecula de interes., Dacă astfel de teste sunt utilizate pentru screeningul sau caracterizarea compușilor, este important să se asigure că testul este configurat astfel încât să măsoare inhibarea enzimei țintă și nu a enzimei(enzimelor) de cuplare . În cazul în care se suspectează interferențe semnificative din partea componentelor probei de testare, trebuie luate în considerare cu atenție etapele precum precipitațiile (imuno) sau purificarea parțială pentru a elimina astfel de componente . Punctul cheie este, indiferent de formatul testului adoptat, să fim atenți la sursele potențiale de interferență și la modalitățile de eliminare sau minimizare a impactului acestora asupra testului., Nu trebuie să se presupună că un test dezvoltat pentru măsurarea unei molecule dintr-un anumit tip de țesut/celulă/fluid biologic va funcționa acceptabil atunci când testul este efectuat pe probe dintr-o altă sursă; testul va trebui să fie validat din nou pentru noua sursă de probă.

pentru a oferi date fiabile, utilizabile, testul trebuie să fie robust și reproductibil. Testul trebuie să fie robust, deoarece nu este afectat în mod nejustificat de modificările în pregătirea și manipularea probelor., În egală măsură, ar trebui să dea aceleași rezultate, indiferent de persoana care efectuează testul. Testul ar trebui să fie foarte reproductibil (denumit și precizie), astfel încât gradul de variație să fie cât mai mic posibil, atât pe bază de analiză intra, cât și inter. Pe o singură rulare a testului, replicatele atât ale unui eșantion standard, cât și ale unui eșantion „real” ar trebui să dea valori foarte similare. În mod similar, ar trebui să existe o mică variație zilnică a valorilor testului obținut.,

dacă testul este de a măsura cantitatea absolută (mai degrabă decât relativă) a unei molecule, atunci trebuie calibrat (vezi mai sus) față de un standard acceptat pentru a da o cuantificare exactă. Uneori, fluxul de lucru al testului necesită o analiză semnificativă a eșantionului (de exemplu, concentrarea, eliminarea componentelor eșantionului care interferează etc.)..) pentru ca molecula de interes să poată fi măsurată în mod fiabil. În astfel de cazuri, este foarte de dorit să se includă un standard intern pentru corectarea pierderilor de analit în fluxul de lucru al testului., De exemplu, în cazul testelor SM, extractul care urmează să fie testat poate fi „ghimpat” cu o cantitate cunoscută de izotop stabil al moleculei de interes. Pentru un test HPLC, standardul intern ar putea fi un compus legat structural de molecula de interes și care nu este altfel prezent în proba de test. Utilizarea unui standard intern este deosebit de importantă dacă sunt necesare date cantitative foarte precise și exacte .,

nivelurile de robustețe, reproductibilitate și precizie acceptabile vor depinde de scopul testului și trebuie să fie decise de cercetător pentru propria lor utilizare curentă.

Presupunând o distribuție Gaussiană, două rezultate, de care diferă prin > 2 abateri standard (SD) sunt considerate a fi statistic semnificativ diferite la 95% nivel de încredere., Două rezultate care diferă în mod similar cu >3 DS sunt considerate statistic semnificativ diferite la nivelul de încredere de 99,7%. Astfel, cu cât este mai mare reproductibilitatea (precizia) testului și, prin urmare, cu cât SD-ul citirilor experimentale este mai mic, cu atât testul va fi mai discriminatoriu.

Figura 2. Măsurarea performanței testului.

performanța testului poate fi analizată în mai multe moduri diferite., Raportul semnal-fundal sau fereastra semnal (S / B = semnal mediu / fundal mediu) și raportul semnal-zgomot (s/N = semnal mediu-fundal mediu / SD de fundal) sunt adesea utilizate ca măsuri de performanță a testului. Cu toate acestea, aceste rapoarte nu iau în considerare în mod adecvat variabilitatea testelor. A fost elaborat un test statistic simplu, valoarea Z’, care oferă o măsură a calității testului care ține cont atât de fereastra de semnal, cât și de variabilitatea testului . Cu cât este mai mare valoarea Z’ (Figura 2), cu atât testul este mai discriminatoriu, cu un test perfect având un Z’ de 1., Pentru un test de screening cu debit mare, o valoare Z ‘ de > 0.5 este în general considerată acceptabilă. Deși statistica Z ‘ a fost inițial derivată pentru evaluarea testelor HTS, aceasta este o măsură generală a calității testului și poate fi aplicată oricărui test .

testele cu debit mare utilizate în descoperirea medicamentelor utilizează frecvent reporteri fluorescenți și luminescenți pentru a permite efectuarea automată a unui număr mare de teste., Cu toate acestea, odată cu dezvoltarea de noi tehnologii, există un interes din ce în ce mai mare pentru utilizarea testelor celulare fără etichete care utilizează metode de detectare biofizică . O serie de instrumente pentru teste fără etichete sunt acum disponibile în comerț . Foarte important, testele fără etichete evită potențialul de artefacte cauzate de prezența sistemului reporter. De exemplu , molecula de reporter bioluminescent utilizată în mod obișnuit firefly luciferin este ea însăși un agonist parțial al GPR35, complicând astfel interpretarea datelor compuse/farmacologice., Un beneficiu suplimentar al testelor fără etichetă este faptul că acestea permit screeningul compușilor împotriva nivelurilor endogene de receptori din celulele primare și stem relevante pentru boală .

interacțiuni neașteptate reporter-compus pot apărea, de asemenea, în testele biochimice (în plus față de problemele de stingere și autofluorescență discutate mai sus). De exemplu, o serie de compuși indicate pentru a activa proteina deacetylase activitatea de SIRT1, folosind un TAMRA-etichetate peptide substrat avut nici o activitate în teste enzimatice folosind un neetichetate versiune a aceluiași peptide sau un nativ full-lungime de proteine substrat., Activarea observată cu substratul marcat cu TAMRA a fost un artefact datorită unei interacțiuni fizice directe a compușilor cu fluoroforul TAMRA .astfel ,atunci când se proiectează și se validează testele pentru screening/profilarea compușilor, este important să se ia în considerare potențialul interacțiunilor compus-reporter. Beneficiile potențiale ale utilizării unui test fără etichetă la un moment dat în cascada de screening ar trebui să fie luate în considerare în mod serios.