Exonization eventos ocorrem em íntrons enriquecido com novas transposons
Para investigar o potencial para novas exonization eventos a ocorrer dentro do transcriptoma humano, analisamos mais de 400 shRNA knockdown RNA-seq conjuntos de dados a partir de linhas de células HepG2 para identificar lê mapeamento entre conhecida exões e romance desses sequências (Fig. 1a e a secção “métodos”)., Nós só consideramos mapeamento de leitura para junções exon-exon (EEJs) suportadas por pelo menos 5 leituras e um percentual de spliced em (PSI) valor de pelo menos 5%. Exões novos foram definidos como os ausentes das bases de dados de anotações e todos os conjuntos de dados de controlo não perturbados (Fig. 1a). Confirmando a validade desta abordagem, a knockdown da proteína de ligação ao ARN (RBP) heterogénea da ribonucleoproteína c (hnRNPC) criou os eventos de exonização mais derivados da Alu (ficheiro adicional 1: Figura S1), de acordo com observações anteriores . No total, detectamos 13.103 novos eventos exônicos dentro de 4774 genes ou 30.,6% dos genes que codificam proteínas humanas avaliados sob as perturbações que examinamos.
características genómicas dos intrões com eventos de exonização. um fluxo de trabalho para identificar novos eventos de exonização (ver a seção “Métodos”). Brevemente, RNA-seq do shRNA knockdown das proteínas de ligação ao RNA em HepG2 é analisado por uma estrela com 2 passagens, e então novas junções são incorporadas em arquivos de índice analisados pelo Whippet ., Os exons identificados são filtrados para remover junções e eventos exon-exon que ocorrem em qualquer uma das amostras de controle correspondentes, bem como anotados em bases de dados do genoma. Apenas eventos suportados por > 5 leitura mapeamento sobre junções exon-exon e um por cento spliced em (PSI) superior a 5% estão incluídos. b gráfico que mostra os resultados de uma logística análise de regressão linear objetivo identificar as características importantes na discriminação de íntrons propenso a exonization eventos para todas as outras, explícitas íntrons., Características em negrito contribuem significativamente para o modelo (p < 0,01, Student t test). TSS, local de início da transcrição; ppt_len, polypyrimidine trato de comprimento; 5’ss, 5′-splice site; 3’ss, de 3’splice site; bp_scr, branchpoint pontuação; SS_dist, splice site de distância; BP_num, branchpoint número; AGEZ, AG dinucleotídeo Zona de Exclusão de comprimento; TAD, topologicamente associando domínio; ppt_scr, polypyrimidine trato pontuação (n = 13,103)., c gráfico que mostra os resultados de uma logística análise de regressão linear com vista a identificar o tipo de transposable elementos que de forma mais eficaz discriminar os intrões propenso a exonization acontecimentos em relação a todas as outras, explícitas íntrons. Características em negrito contribuem significativamente para o modelo (p < 0,01, Student t test). Nós são coloridos pela idade média estimada de quando elementos transponíveis surgiram (n = 13.103)., d mapa de enriquecimento para as categorias funcionais GO, REACTOME e KEGG dos genes que contêm eventos de Exonização Alu, com termos Go representativos mostrados para cada sub-rede (ver ficheiro adicional 1: Figura S1 para a versão anotada)., Nó tamanho é proporcional ao número de genes associados com a categoria, de borda e a largura é proporcional ao número de genes compartilhados entre IR categorias
Para investigar os mecanismos subjacentes a estas exonization eventos, agrupados em uma lista de recursos classicamente associados com splicing alternativo, incluindo emendas site de força, conteúdo GC e polypyrimidine trato comprimento (arquivo Adicionais 2: Tabela S1)., Regressão linear logística foi então usada para comparar esses eventos com um grupo de” fundo ” de intrões expressos sem qualquer evidência de exonização (Fig. 1b). Validando a nossa escolha de características genómicas, o nosso modelo atinge uma taxa positiva média de 75,2% (ficheiro adicional 1: Figura S1). Além disso, fomos capazes de confirmar os resultados anteriores que exonization eventos tendem a ocorrer em longo íntrons com um alto conteúdo GC (arquivo Adicionais 1: Figura S1, intron comprimento: p < 3.53 × 10-59, GC 1.01 × 10-73, teste t de Student)., Nomeadamente, encontramos exonization eventos muitas vezes se sobrepõem nucleosome sítios de ligação (arquivo Adicionais 1: Figura S1, p < 2.37 × 10-23, teste de Wilcoxon), raramente ocorrem no 3-final do gene do corpo (p < 5.90 × 10-21, teste t de Student) e não mostram uma tendência significativa para ocorrer no prazo de 5-UTRs (arquivo Adicionais 1: Figura S1, p < 7.13 × 10-166, teste exato de Fisher). Importante, também observamos que o preditor mais forte para a exonização foi a ocorrência de elementos transponíveis sobrepondo o novo exon (Fig., 1B e Ficheiro adicional 1: Figura S1, p < 6.46 × 10-127, Teste do estudante t). Em comparação com estes predictores fortes, nenhum elemento de splicing regulamentar cis contribui significativamente para o modelo ou mostra diferenças significativas entre os conjuntos de dados (ficheiro adicional 1: Figura s1, p > 0,05, Student t test).
para avaliar a conservação do novo uso de exon em espécies, analisamos a extensão da exonização em vários tipos de tecidos emparelhados dentro de quatro espécies de primatas abrangendo 30 milhões de anos de evolução de primatas., Para explorar o uso de exonização entre amostras, genes com eventos que ocorrem em todas as quatro espécies foram identificados e ordenados usando agrupamento de propagação de afinidade. De acordo com o splicing alternativo canônico , amostras da mesma espécie invariavelmente agrupadas em conjunto (arquivo adicional 1: Figura S2). A notável exceção a esta tendência foi observada em amostras dos testículos, que mostraram clustering específico do tecido. Isto sugere que dentro dos testículos há uma forte assinatura de exonização conservada através de espécies de primatas em vários genes (arquivo adicional 1: Figura S2).,
para investigar mais a influência dos retrotransposons na exonização, nós sub-dividimos os elementos transposíveis em suas principais sub-famílias. De acordo com a linhagem-especificidade dos eventos de exonização, os contribuintes mais significativos para o modelo são transposons com menos de 70 milhões de anos. Em particular, os elementos Aluj e Alus, bem como os elementos L1 altamente móveis, são fortes predictores (Fig. 1c). Curiosamente, uma exceção a esta regra é a sub-família AluY , que mostra um padrão reminiscente de eventos de transporte muito mais antigos (Fig. 1c)., Esta diferença é potencialmente devida à sua depleção relativa dentro dos corpos genéticos (3%, 19%, AluY, AluS, ocorrência nos intrões expressos). Finalmente, quisemos avaliar que tipo de genes contém eventos de Exonização Alu. Curiosamente, encontramos um forte enriquecimento para funções relacionadas com a sinalização celular e regulação do ciclo celular(Fig. 1D, ficheiro adicional 1: Figura S1 e Ficheiro adicional 3: Quadro S2). Juntamente com exemplos anteriores , a nossa observação de um grande número de eventos de exonização sobrepondo novos transposons sugere uma nova fonte de complexidade transcriptômica.,uma avaliação dos trans-factores que promovem a exonização (ficheiro adicional 1: Figura S2 e Ficheiro adicional 4: Tabela s3) revelou um enriquecimento dos RBPs de ligação m6a (n6-metiladenosina), especialmente entre exões novos contendo alumínio (Fig. 2a, p < 0, 05, ensaio hipermétrico). Isto incluiu hnRNPC , que tem sido mostrado anteriormente para induzir um grande número de Eventos de exonização específica Alu, bem como síndrome de DiGeorge região crítica 8 (DGCR8) e YTH domínio-contendo proteína 2 (YTHDC2)., Para examinar o potencial papel das marcas m6a na exoneração, analisamos os dados de knockdown da enzima de modificação m6a n6-adenosina-metiltransferase subunidade (METTL3) . Esta análise revelou um aumento significativo no número de eventos de exonização detectáveis após a queda do METTL3 (Fig. 2b, p < 3.57 × 10-03, Wilcox-rank sum test), em concordância com o M6A que regula a inclusão de novos exons. Uma análise mais aprofundada destes eventos de exonização dependentes de METTL3 revelou um enriquecimento funcional dos genes associados a danos no ADN (p < 2.,68 × 10-02, valor p corrigido em FDR). Em seguida, analisamos dados de células HeLa que constituem duas contagens de Reguladores conhecidos de M6A (fator 3 (SRSF3) e proteína 1 (YTHDC1) ricos em Serina/arginina) e duas contagens de RBPs que não reconhecem diretamente M6A (fator 9 e 10 rico em Serina/arginina (SRSF9 e SRSF10). De acordo com os resultados anteriores, descobrimos que o knockdown do SRSF3 ou YTHDC2 induz fortemente a exonização, enquanto diminuir a expressão do SRSF9 ou SRSF10 tem pouco ou nenhum impacto (arquivo adicional 1: Figura S2).,
m6a metilação suprime exonization. a Barplots of m6a-methylation associated genes and the number of novel exons identified upon knockdown in HepG2 cells b Barplot showing number of exonization events induced upon knockdown of n6-adenosina-metiltransferase (METTL3) compared to a control sample. valor de p calculado com base no teste de soma Wilcoxon-rank. C Boxplots exibindo picos intrônicos de M6A por nucleótido do ARN nascente nas células HepG2., Os elementos Alu de Genomewide ocorrem dentro dos intrões expressos sem Eventos de exonização identificados. Boxplots apresentar o intervalo interquartílico como uma caixa sólida, 1,5 vezes o intervalo interquartílico como vertical, linhas finas, a mediana como uma linha horizontal e, o intervalo de confiança em torno da mediana como um entalhe. nt, nucleótido (n = 13,247). D gráfico que mostra a cobertura relativa do m6a nos nucleótidos que rodeiam os elementos Alu. Ver c para a descrição de “genoma-wide”., (n=13,247)
para avaliar se a modificação m6a impacta eventos de exoneração, avaliámos o enriquecimento dos sítios M6A dentro de sequências exoneradas . Esta abordagem utilizou BrU-seq seguida pelo isolamento de fragmentos metilados m6a utilizando um anticorpo específico m6a . Devido à natureza repetitiva dos elementos Alu, usamos a maximização da expectativa para atribuir leituras multimapping (máximo de 10 jogos permitidos) aos elementos Alu baseados na expressão do gene hospedeiro ., Como um conjunto de comparação, examinamos todos os elementos Alu dentro de regiões intronic expressadas que não estão na vizinhança de um exon novo (veja a seção “Métodos”). Esta análise revelou um forte enriquecimento do mapeamento de sítios m6a para elementos Alu exonerados (Fig. 2c, p < 3.23 × 10-123, teste de Wilcoxon rank-sum; Fig. 2d, p < 2.13 × 10-63, teste de soma de Wilcoxon rank; ficheiro adicional 1: Figura S2). Ao todo, isso sugere que a modificação m6a e as proteínas de ligação são reguladores chave de eventos de exonização (contendo Alu).,os mecanismos que aumentam a “janela de oportunidade” para o recrutamento de spliceosome promovem a exonização
a nossa análise inicial revelou que a previsão da exonização é fortemente reforçada por elementos repetitivos, comprimento intron e conteúdo GC. Estas características são conhecidas por correlacionar negativamente com a taxa de alongamento da ARN polimerase II (RNAPII). Nós, portanto, hipotetizamos que as mudanças na taxa de Elongação RNAPII podem promover a exonização., Para testar isso, analisamos os dados RNA-seq das células humanas expressando mutações que aumentam (E1126G) ou diminuem (R749H) a taxa de Elongação da RNA polimerase II (RNAPII) . Para determinar a taxa de elongação de cada mutante, analisámos dados do ensaio de sequenciação nuclear em toda a genoma (GRO-seq) combinado com o inibidor de Elongação da transcrição DRB (ver a secção “métodos” e ). Observamos que mutações retardando a taxa de Elongação RNAPII (R749H)induziram fortemente eventos de exonização (Fig. 3a, ALL: p < 3.,18 × 10−45, Fisher’s exact test), with this change especially strong in Alu-containing novel exons (Fig. 3a, ALU: p < 5.62 × 10−53, Fisher’s exact test). In contrast, mutations that speed up elongation had negligible effects on the number of exonization events detected (Fig. 3a; p > 0.05, Fisher’s exact test).
Reduced rate of RNA polymerase II elongation and poor splicing efficiency promotes exonization., um gráfico que mostra o impacto das mutações da ARN polimerase na exonização de exões contendo Alu. WT, wildtype; mutação rápida E1126g; mutação lenta, R749H. Cada ponto representa um conjunto de dados individual. KB, kilobase; min, Min., Min. Elongação, taxa de Elongação transcritional (ver a seção “Métodos” e ). B Boxplot of splicing efficiency for introns with exonization events vs all expressed introns with no evidence of exonization. Splicing efficiency é uma métrica que descreve a velocidade da excisão intron medida pela avaliação do ARN-seq nascente usando BrU-chase em 0, 15, 30 e 60 min. Ver Fig., 2d para a descrição dos folhetos de caixa. *** p < 1 × 10-10 p valor calculado utilizando o teste da soma de Wilcoxon-rank. (n = 4,011). c gráfico de barras empilhadas mostrando distribuições de introns para a eficiência de splicing identificado por BrU-chase. Grupos atribuídos por K-significa agrupamento (k = 5) (ver a secção “métodos”)—ver o ficheiro adicional 1: Figura S3a para as distribuições de eficiências de ligação., (n = 83,972)
Este resultado suporta o modelo de competição de splicing alternativo em que o regulamento do exão inclusão está associada uma “janela de oportunidade” para a spliceosome reconhecimento. Se esta ligação entre a exonização e a oportunidade for válida, deve ocorrer um mecanismo independente para o aparecimento de novos exões dentro de intrões que são lentamente processados pela máquina de splicing., Para avaliar esta hipótese, analisamos dados de RNA nascentes de BrU-Chase-seq, em que as células são rotuladas com um pulso BrU de 15 min e perseguidas por 0, 15, 30 e 60 min. Para determinar a cinética de splicing para cada intron, calculamos a dinâmica de eficiência de splicing (SEDs) ou a taxa de excisão de intron (ver a seção “Métodos”). K-means clustering was then used to identify five groups of introns with SEDs ranging from very fast to very slow (Additional file 1: Figure S3). Introns contendo eventos de exonização foram então comparados a um conjunto de fundo de todos os introns expressos., Surpreendentemente, esta análise revela que os introns que contêm eventos de exonização são fortemente enriquecidos dentro do aglomerado SED mais lento (Fig. 3b, p < 3.23 × 10-239, teste de classificação de Wilcox e Ficheiro adicional 1: Figura S3). Além disso, estes introns apresentam uma redução muito significativa na SED em comparação com os grupos de fundo (Fig. 3C and Additional file 1: Figure S3, p < 2.2 × 10-160, Wilcoxon rank-sum test)., Em conjunto, estas observações sugerem que os mecanismos que expandem a” janela de oportunidade ” irão aumentar a probabilidade de reconhecimento pela máquina de splicing e, assim, promover a taxa de exoneração.o processo exógeno pode também promover alterações no alongamento da transcrição e, portanto, pode alterar as taxas de exonização., Para investigar esta questão, concentrámo-nos na irradiação UV, uma vez que estudos anteriores demonstraram que promove tanto a hiperfosforilação do RNAPII, conduzindo à subsequente inibição do alongamento da transcrição, como o recrutamento da maquinaria m6a para locais de danos ao ADN . Utilizando dados obtidos a partir do Nascente RNA-seq (protocolo GRO-seq), avaliámos o impacto da irradiação UV sobre a Exonização Alu-durante um período de 24 horas . Notavelmente, após a diminuição acentuada da taxa de Elongação RNAPII sobre a irradiação UV, encontramos um aumento igualmente marcante da taxa de exonização (Fig., 4A e Ficheiro adicional 1: Figura S4). Esta incorporação de novos exons continua a aumentar enquanto a taxa de Elongação RNAPII permanece baixa. Importante é que a recuperação total da taxa de alongamento RNAPII na marca de 24-h é acompanhada por uma queda precipitada no número de eventos de exonização detectáveis (Fig. 4A e Ficheiro adicional 1: Figura S4).
irradiação UV aumenta o número de exonização dentro dos genes do ciclo celular promovendo a retenção transcript no núcleo., uma parcela linear com os resultados da análise GRO-seq após irradiação UV (ultravioleta). A linha pontilhada representa a estimativa com base nos dados do papel original . Ver os dados originais no ficheiro adicional 1: Figura S4. A região sombreada amarela representa a aplicação UV (n = 3,278). b gráfico de distribuição cumulativa da variação na expressão dos genes dentro da fracção polissémica em comparação com a fracção celular inteira. Uma parcela de distribuição cumulativa descreve a proporção de dados (eixo y) inferior ou igual a um valor especificado (eixo x). Distribuição cumulativa F (x), função de distribuição cumulativa., valor de p calculado com base no teste de soma Wilcoxon-rank. C Boxplots que apresentam alterações normalizadas [alteração no TPM/max (TPM)] na diferença de expressão entre o RNA-seq total e o RNA-seq ribossomal acoplado após irradiação UV. Os Genes são aglutinados por percentagem de esplicados no aumento (PSI) do exon original exonizado após irradiação UV. Tamanho da amostra do cesto da esquerda para a direita: n = 427, 158, 355, 410 e 438. Ver Fig. 2d para a descrição dos folhetos de caixa. Valores de P calculados com base no teste de soma Wilcoxon-rank. TPM, transcrições por milhão., d categorias funcionais de genes que são submetidos a exonização após irradiação UV em comparação com o conjunto de dados de controlo (ver também o ficheiro adicional 1: Figura S4). FDR, false discovery rate
dadas as constatações anteriores de que sequências contendo Alu podem promover a retenção nuclear , investigámos se, após irradiação UV, o envolvimento polissémico dos genes foi afectado pela exonização ., Notavelmente, após a irradiação UV, identificamos uma diminuição significativa nos níveis de expressão dos genes que contêm eventos de exonização contendo Alu dentro da fração polissómica, em comparação com a expressão RNA-seq da célula inteira (Fig. 4b, p < 8.50 × 10-22, teste de Wilcoxon rank-sum). Além disso, a resistência mediana desta depleção aumenta com a percentagem de inclusão dos novos exons (Fig. 4c, p < 1,49 × 10-06, teste de classificação de Wilcox).,em seguida, interessou-nos investigar o tipo de genes em que os eventos de exonização são promovidos após a irradiação UV. Curiosamente, há um forte enriquecimento para os genes envolvidos na regulação do ciclo celular e ligação ao ARN(Fig. 4D e Ficheiro adicional 1: Figura S4). Ao todo, estes resultados sugerem que os danos ao DNA reduzem o engajamento ribossômico dos genes do ciclo celular parcialmente através da promoção de eventos de exonização contendo elementos Alu, que são conhecidos por induzir a retenção nuclear ., Por último, investigámos se se tratava de um mecanismo evolutivamente conservado através da avaliação das taxas de exonização aquando da irradiação UV em fibroblastos embrionários de ratinhos. Notavelmente, identificamos um aumento claro dos eventos de exonização em amostras tratadas com UV versus não tratadas com a inclusão de repetições B específicas de roedores particularmente afetadas (arquivo adicional 1: Figura S4). A análise funcional dos genes que contêm exões novos revelou mais uma vez um forte enriquecimento dos genes do ciclo celular (ficheiro adicional 1: Figura S4).,
A Exonização está esgotada em cancros hematológicos
splicing aberrante é um traço característico do cancro e contribui para vários aspectos da biologia tumoral . Mudanças associadas ao câncer em splicing têm sido ligadas à expressão alterada de RBPs, algumas das quais são oncogênicas ou atuam como supressores do tumor . Apesar de evidências extensas de splicing alterado no câncer, a extensão em que essas mudanças impacto exonização não foi explorada., Portanto, avaliamos a ocorrência de exonização através de amostras de tumor emparelhado e amostras de controle de pacientes dentro de uma variedade de diferentes cancros (arquivo adicional 5: Tabela S4). Notavelmente, esta análise revelou uma supressão significativa e reprodutível da exonização em amostras de pacientes com leucemia linfocítica crônica (LLC) e síndromes mielodisplásicas (MDS) (Fig. 5a, CLL: p < 2.14 × 10-04; MDS: p < 1.15 × 10-04; AML: p < 4.,02 × 10-09; teste Wilcoxon rank-sum), que foi independente de mudanças de expressão (arquivo adicional 1: Figura S5). Além disso, esta supressão da exonização é específica a neoplasias hematológicas (Fig. 5b, p < 2.93 × 10-09, teste de soma de Wilcoxon rank). Consistente com as nossas observações anteriores, a inclusão de novos exões é suprimida dentro dos genes associados ao ciclo celular e ao processamento do mRNA (ficheiro adicional 1: Figura S5 e Ficheiro adicional 6: Tabela S5, p < 1 × 10-5, FDR corrigido, em comparação com amostras de controlo).,
Hematologic cancers display decreased exonization. a Boxplots displaying percentage change in Alu-exonized events compared to matched patient controls. Dots represent data from individual samples. See Fig. 2c for the description of boxplots. SCLC, small cell lung cancer; MDS, myelodysplastic syndromes; CLL, chronic lymphocytic leukemia; AML, acute myeloid leukemia. b Boxplots showing data from a collated into two major cancer types. See Fig., 2c para a descrição dos folhetos de caixa. C Boxplots que mostram alterações na exonização da Alu em relação a amostras de controlo correspondentes em linhas celulares que expressam proteínas de ligação ao ARN com mutações de cancro conhecidas. Ver Fig. 2c para a descrição dos folhetos de caixa. o gráfico D mostra alterações na exonização Alu de amostras MDS agrupadas por genes que contêm mutações. Cada ponto representa dados de um estudo individual. o gráfico Dot que mostra o número de acontecimentos exonerados em amostras de linha celular SET2 e em amostras de doentes antes e depois da administração do inibidor da bromodomain ARV-825., Também estão incluídas amostras de controlo saudáveis independentes do mesmo tipo de células (CD34+). ARV-825, BRD4 inibidor
Recentes todo-todo o genoma de estudos de sequências de amostras de doentes com síndromes mielodisplásicas revelaram frequentes mutações somáticas em um grupo chave de spliceosome associadas a proteínas, incluindo proteínas Serina/arginina rica de emenda do fator 2 (SRSF2) e fator de Splicing U2AF 35 kDa subunidade.
(U2AF1) . Estas mutações resultam na sobreposição de centenas de transcrições ., Dado o trabalho anterior ligando eventos de regulação e exonização do U2AF1, nós exploramos se esses tipos de mutações podem ajudar a explicar a supressão da exonização observada nos dados do paciente. Para investigar esta possibilidade, analisamos GRO-seq dados a partir de um HEK-293 linha de células expressando tipo selvagem (SRSF2 ou U2AF1) ou mutante factores de splicing (SRSF2(P95H), U2AF1(Q157P)) e sem (U2AF1(S34F)) ganho de splicing função de mutações . Esta análise revelou que tanto a mutação P95H dentro do SRSF2 como a mutação Q157P dentro do U2AF1 inibiram a taxa de inclusão de novos exões(Fig., 5c, p < 1,46 × 10-03, Wilcox-rank sum test, compared to controls) while the S34F in U2AF1 had little effect. Para investigar se essas mudanças refletem a carga mutacional das amostras de pacientes MDS, agrupamos esses dados com base em mutações genômicas dentro de suas RBPs. De acordo com os dados da linha celular, esta análise revelou uma estratificação da exonização baseada no tipo de mutação genômica RBP (Fig. 5D e Ficheiro adicional 1: Figura S5).,
para investigar se esta supressão da exonização em cAML poderia ser aliviada pela diminuição da taxa de Elongação transcritional, avaliamos o impacto da droga ARV–825, que é conhecida por inibir a elongação RNAPII, promovendo a degradação da proteína 4 contendo Bromodomain (BRD4) . A análise de amostras de pacientes cAML replicou nossos resultados anteriores mostrando supressão da exonização (Fig. 5e). Importante, esta supressão é revertida após a aplicação de inibidores BRD4 com um aumento de 12 vezes no número de eventos de exonização detectados(Fig., 5e, p < 4,86 × 10-91, ensaio hipergeométrico). Ao todo, isso sugere em cancros do sangue eventos de exonização dentro dos genes do ciclo celular é suprimido, mas pode ser fortemente revertido por intervenção farmacológica que aumenta a “janela de oportunidade”.
