Frequência de CCR5 Delta-32 Mutação no Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)-soropositivos e expostos ao HIV Soronegativos Indivíduos e na População em Geral de Medellín, Colômbia
Vol. 95( 2): 237-242, Mar./Abril.,87″>
Francisco J Díaz, Jorge a Vega, Pablo J Patiño*, Gabriel Bedoya,
Jorge Nagles**, Cecilia Villegas**, Rodrigo Vesga***, Maria T Rugeles/+
Laboratório de Virologia *Laboratório de Imunologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Antioquia, AA 1226, Medellin, Colômbia **Instituto dos seguros sociais, Medellin, Colômbia ***Instituto Metropolitano de saúde, Medellin, Colômbia
Repeated exposure to human immunodeficiency virus (HIV) does not always result in seroconversion., Modificações no núcleo de receptores para a entrada do HIV para as células alvo são um dos fatores que bloqueiam a infecção. Estudamos a frequência da mutação Delta-32 no gene ccr5 em Medellin, Colômbia. Duzentos e dezoito indivíduos distribuídos em três grupos diferentes foram analisados para Delta-32 mutação no gene ccr5 por reação em cadeia da polimerase (PCR): 29 seropositivas (SP), 39 exposto seronegativos (ESN) e 150 indivíduos como uma amostra da população geral (GPS). A frequência do alelo mutante Delta-32 foi de 3,8% para a ESN, 2,7% para GPS e 1,7% para SP., Apenas um genótipo mutante homozigótico (Delta-32/Delta-32) foi encontrado entre o ESN (2, 6%). O genótipo heterozigótico (ccr5/Delta-32) foi encontrado em oito GPS (5, 3%), num SP (3, 4%) e num ESN (2, 6%). As diferenças nas frequências alélicas e genotípicas entre os três grupos não foram estatisticamente significativas. Uma comparação entre as frequências genotípicas esperadas e observadas mostrou que estas frequências eram significativamente diferentes para o grupo ESN, o que sugere indirectamente um efeito protector do genótipo mutante (Delta-32/Delta-32)., Uma vez que este genótipo mutante explicou a resistência da infecção em apenas uma das nossas pessoas ESN, diferentes mecanismos de proteção devem estar desempenhando um papel mais importante nesta população.,
palavras-Chave: CCR5 – ∆ 32 mutação – vírus da imunodeficiência humana (HIV), infecção expostos soronegativa
Desde o início da síndrome da imunodeficiência adquirida (Aids) epidemia, foi determinado que a atividade sexual com múltiplos parceiros era o principal fator de risco para aquisição do vírus da imunodeficiência humana (HIV), a infecção com o subsequente desenvolvimento da Aids., No entanto, há fortes evidências sugerindo uma resistência natural à infecção em vários indivíduos que permaneceram não infectados, apesar do fato de que eles tiveram várias exposições ao HIV, especialmente através de relações sexuais (Paxton et al. 1996). A base biológica para esta resistência está apenas começando a ser compreendida.
insira a célula-alvo do HIV requer a presença da molécula CD4, que atua como receptor, e de uma segunda molécula ou coreceptor, que, na maioria dos casos, é um antagonista do receptor (Deng et al. 1996, Feng et al. 1996)., Entre os receptores de quimiocina, CCR5 e CXCR4 são os principais receptores de entrada do HIV.
Quase que simultaneamente com a descoberta do HIV coreceptors, uma mutação no gene que codifica a molécula CCR5 foi descrito, o que confere um alto grau de resistência à infecção por HIV in vitro e in vivo (Paxton et al. 1996, Liu et al. 1996). Esta mutação chamada Delta-32 consiste em uma deleção de 32 pares de bases que codifica uma proteína não-funcional, e como resultado, ela não é expressa na membrana celular., Os indivíduos homozigóticos para esta mutação não têm qualquer alteração imunológica ou biológica conhecida (Liu et al. 1996).
o alelo Delta-32 está presente principalmente na população caucasiana (Liu et al. 1996, Martinson et al. 1997, Magierowska et al. 1998). Nos Estados Unidos a frequência é de 8% a 10% na população branca, mas menos de 1% em indivíduos Afro-americanos. Há também uma frequência muito baixa de mutação entre caucasianos na Ásia (Paquistão e Índia) e não foi relatada na China, Japão ou população africana pura (Martinson et al. 1997)., Na América Latina, as frequências mal foram estudadas. Não foi detectado entre 32 indivíduos da Venezuela nem em grupos ameríndios (Liu et al. 1996, Martinson et al. 1997). Na Colômbia não há relatórios que abordem esta questão.
No sexualmente expostas ao HIV, mas indivíduos soronegativos (ESN), a freqüência de Delta-32/Delta-32 genótipo atinge 2,8% para 3,6%, o que corresponde a duas a três vezes a freqüência encontrada em Branco não-expostos população (Dean et al. 1996, Huang et al. 1996)., Esta frequência pode ir até 33% em pessoas com maior risco de infecção (Huang et al. 1996). Em contraste, indivíduos infectados pelo HIV exibem a menor frequência do alelo Delta-32. Considerou-se que os indivíduos com genótipo mutante homozigótico (Delta-32/Delta-32) eram 100% resistentes à infecção pelo VIH, pelo menos com estirpes com tropismo m, que utilizam a molécula CCR5 como coreceptor. No entanto, recentemente foram notificados casos de infecção por VIH em dois indivíduos que são homozigóticos para o alelo mutante (Delta-32/Delta-32) (Biti et al. 1997)., Estas infecções podem ter ocorrido com estirpes com tropismo para o tropismo que utilizam a molécula CXCR4 como coreceptor para entrar nas células alvo.
foi difícil estabelecer se o genótipo ccr5/Delta-32 confere algum grau de resistência à infecção. Os estudos sobre este aspecto são contraditórios (Sansão et al. 1996, Dean et al. 1996, Huang et al. 1996, Hoffman et al. 1997).,
a Partir da literatura pode-se concluir que a Delta-32/Delta-32 genótipo confere um alto grau de proteção para a infecção pelo HIV, mas não é o principal fator associado à resistência, uma vez que a maioria dos ESN falta deste fator genético. Diferentes mecanismos, tais como outras mutações do coreptor ou factores imunológicos, podem explicar a ausência de infecções neste grupo de alto risco.,
Este estudo foi realizado para estimar a freqüência de Delta-32 alelos e genótipos para o gene ccr5 em diferentes subgrupos: ESN, soropositivos e população em geral, a fim de explorar a influência do fator genético no comportamento da infecção pelo HIV em nosso país.,
MATERIALS AND METHODS
RESULTS
DISCUSSION
MATERIALS AND METHODS
Population -The study was carried out in three groups of individuals., ESN: pessoas com história de relações sexuais repetidas sem protecção com indivíduos infectados pelo VIH. O número de indivíduos deste grupo é perto do universo de conhecidos ESN em nossa cidade; SP: todas as pessoas incluídas neste grupo foram parceiros sexuais de Snes que tinha anticorpos anti-HIV e alguns deles também apresentou sinais clínicos da infecção pelo HIV; GPS: esta população foram voluntários adultos, a maioria deles estudantes e trabalhadores de nossa instituição ou instituições de saúde relacionados com a nossa universidade. Nenhum deles foi seleccionado com base no risco de infecção pelo VIH., O status serológico do HIV para pessoas deste grupo não foi determinado.
Serological status – The serological status for individuals in the ESN group was confirmed by an ELISA test (Enzygnost HIV-1+2 Plus, Behring Diagnostics, Margurg, Germany). determinação do genótipo
– a determinação do genótipo foi efectuada como descrito anteriormente (Michael et al. 1997). Brevemente, a amostra de sangue periférico foi colhida com EDTA como anticoagulante. As células mononucleares foram separadas por gradiente Ficoll-Hipaque., Parte das células foi criopreservada para futuros estudos funcionais. As células restantes foram usadas para extração de DNA usando a técnica fenol-clorofórmio. O segmento específico do gene ccr5 foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) usando os seguintes iniciadores: CCR5-Delta1 (5′-ACCAGATCTCAAAAAAGAAGGT CT-3′) e CCR5-Delta-2 (5′-CATGATGGGGAAG ATAAGCTCACA-3′). A reacção continha 5 pmol de cada primário, 0,3 unidades de Taq ADN polimerase (Perkin-Elmer), 2 mM de MgCl2 e 200 µM de cada dNTP num volume final de 25 µl., A reação foi objecto de 30 ciclos de amplificação com três temperaturas de 96°C x 15 s, 58°C x 60 seg e 72°C x 60 seg. O resultado da amplificação foi electrophoresed em 2% gel de agarose, corado com brometo de etídio e visualizados sob U. V. transillumination. Para o genótipo Selvagem (ccr5/ccr5), o produto PCR foi de 225 bp, enquanto um produto de 193 bp indicou um homozigótico mutante (Delta-32/Delta-32). A presença de ambas as bandas indicou um genótipo heterozigótico (ccr5/Delta-32) (figura).,
análise estatística – as frequências alélicas e genotípicas encontradas foram comparadas e as diferenças avaliadas usando o teste Qui quadrado (chi2). As diferenças entre as frequências esperadas e as observadas dos genótipos foram avaliadas pelo mesmo teste.
RESULTADOS
estudamos 218 indivíduos divididos em três grupos: ESN, SP e GPS. A sua distribuição e perfil demográfico são apresentados na tabela I. todos os grupos tinham uma média etária semelhante., Os grupos GPS e ESN tinham uma distribuição semelhante de gênero, mas diferente do Grupo SP em que os machos eram predominantes. A maioria dos casais eram heterossexuais e poucos eram homossexuais ou indivíduos não-comparados com preferências Bissexuais. Todos os indivíduos seropositivos adquiriram a infecção através de relações sexuais.
as frequências do genótipo são indicadas na tabela II. a frequência mais elevada foi para o genótipo Selvagem (ccr5+/ccr5). O genótipo heterozigótico (ccr5+/Delta-32) foi encontrado em oito GPS, em um SP e em um ESN., Apenas um genótipo mutante homozigótico (Delta-32/Delta-32) foi encontrado entre o ESN (figura). A diferença nas frequências entre os três grupos estudados não foi estatisticamente significativa. As frequências alélicas para ccr5 e Delta-32 são mostradas na tabela III. a frequência do alelo mutante Delta-32 foi de 3,8% para ESN, 2,7% para GPS e 1,7% para SP. As diferenças não foram estatisticamente significativas.
com base nas frequências alélicas de cada grupo é possível prever a frequência do genótipo, considerando que eles seguem o equilíbrio Hardy-Weinberg., O que significa que as freqüências têm uma distribuição binomial de acordo com a seguinte equação: p2 + 2pq + q2 = 1, onde p e q são as frequências alélicas do ccr5+ e Delta-32, respectivamente, e p2, 2pq e q2 são as freqüências do genótipo do ccr5+/ccr5+, ccr5+/Delta-32 y Delta-32/Delta-32, respectivamente. Na tabela IV é apresentada uma comparação entre as frequências genotípicas esperadas e observadas., Em SP e GPS as frequências observadas são semelhantes às esperadas, enquanto no grupo ESN a frequência observada diferia significativamente da frequência esperada ficando longe do equilíbrio Hardy-Weinberg (p<0.0005).
uma vez que o número de indivíduos na ESN grupo e a frequência de Delta-32 foram baixos, não foi possível estabelecer uma relação entre ccr5 genótipo e alguns comportamentos de risco, tais como a freqüência do uso de preservativo, o tipo de relação sexual, e o tempo de exposição., A única pessoa com um genótipo homozigótico mutante foi uma mulher que teve uma relação sexual estável durante três anos com uma média de oito intercomunicações sexuais não protegidas por mês com o marido infectado. O sujeito com genótipo heterozigótico encontrado neste grupo corresponde a um homem bissexual promíscuo que teve frequentemente intercourses sexuais anal durante sete meses com um casal infectado.,
DISCUSSÃO
A composição étnica da população Colombiana é um produto da mistura de Europeus, Africanos e Índios. A contribuição da Europa é principalmente espanhola (Bravo et al. 1996). Dois relatórios de Delta-32 frequência na população espanhola mostrou um alelo frequência de 8,6% (IC 95% 4.9-12.3%) em Basques, de 8,2% (95%CI 5.4-10.9%) em Catalães e de 5% (95%CI 2.0-8.0%) em indivíduos a partir de San Sebastian (Martinson et al. 1997, Magierowska et al. 1998).,
No nosso estudo, a freqüência de Delta-32 para o GPS do grupo foi de 2,7% (IC 95% 0.90 – 4.5%). Com base neste resultado, podemos calcular que o componente espanhol do GPS está próximo ou mesmo inferior a 50%. Esta estimativa é diferente de um relatório anterior de Bravo et al. (1996), em que utilizando um painel de diferentes marcadores genéticos observaram uma prevalência do componente europeu sobre as outras raças da população da nossa província (Antioquia)., Uma vez que a amostra GPS não só incluía pessoas nascidas em Antioquia, mas residentes desta província, é possível que um número significativo de indivíduos incluídos neste grupo nasceram em diferentes províncias onde a influência da raça europeia não é conhecida. Este fato pode explicar a baixa prevalência observada de Delta-32.
embora este estudo tenha encontrado uma maior prevalência do alelo Delta-32 e do genótipo Delta-32/Delta-32 entre a ESN, as diferenças nas frequências não foram significativas (tabelas II, III)., Provavelmente o tamanho reduzido da amostra não permitiu mostrar uma associação significativa entre genótipo e infecção.
Na ausência de selecção positiva e negativa ou de outros fatores como freqüência de migração recente, a alta taxa mutacional ou alto índice de endogamia, a distribuição dos genótipos em cada grupo deve ser semelhante para os valores previstos a seguir o Hardy-Weinberg distribuição. O GPS exibiu uma distribuição genotípica em equilíbrio., Uma vez que a circulação do HIV é um fator de Seleção, este fato poderia ter duas explicações: a frequência do genótipo protetor Delta-32/Delta-32 é muito baixa para ser perceptível, ou o grau de exposição ao HIV ainda é baixo nesta população. Conhecendo a frequência do alelo Delta-32, calculamos a frequência do genótipo Delta-32/Delta-32 como 0,00071. Isto significa que apenas uma pessoa entre 1406 indivíduos carregaria o genótipo homozigótico mutante (Delta-32 / Delta-32).
a distribuição de genótipos em SP é também de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg., A explicação deste fato neste grupo é mais difícil, uma vez que todos os indivíduos foram sexualmente expostos ao HIV e isso deve ter selecionado positivamente o genótipo Selvagem ccr5+/ccr5+. É possível que a rápida evolução para a Aids e a morte de indivíduos portando selvagem genótipos nos heterozigotos poderia compensar este efeito, mas, novamente, a baixa frequência de Delta-32 alelo faz a análise difícil.,
a falta de equilíbrio nas frequências genotípicas entre a ESN foi altamente significativa devido à presença de um indivíduo com o genótipo Delta-32 / Delta-32. Isto torna a frequência 17 vezes superior ao esperado (tabela IV). Esta constatação é dificilmente explicada por um dos seguintes argumentos que podem também contribuir para quebrar o equilíbrio Hardy-Weinberg numa população: recente imigração europeia e endogamia, uma vez que estes factos não são frequentemente encontrados entre a nossa população. A taxa de mutação desta mutação também não deve ser elevada., A possibilidade desta distribuição ter ocorrido aleatoriamente também é muito baixa (p<0, 0005). A seleção positiva de indivíduos com tal genótipo Delta-32 / Delta-32 entre o ESN é a explicação mais plausível para a falta de equilíbrio. Por conseguinte, o efeito protector deste genótipo foi demonstrado, embora indirectamente.
no nosso estudo, a frequência do genótipo Delta-32/Delta-32 apenas explica a resistência à infecção numa percentagem muito baixa de indivíduos com NES (2,6%)., Isto é concordante com outros estudos que mostraram achados semelhantes (Bernard et al. 1999). Uma vez que muitos dos indivíduos do grupo ESN tiveram um alto grau de exposição ao HIV, deve haver outros mecanismos responsáveis por esta “proteção natural”. Recentemente, foi demonstrado que o HIV poderia usar outros receptores quimiocinos como CCR2 e CCR3 como correceptores (Berger et al. 1999). Portanto, mutações nestas moléculas ou nos receptores de quimioquina ligantes podem explicar a resistência à infecção pelo HIV de alguns indivíduos., No entanto, a mutação CCR2-64I, não foi associada a um fenótipo resistente, mas sim a um atraso na progressão da doença (Smith et al. 1997). Da mesma forma, o polimorfismo SDF-1-3’a relatado na Alfa-chemokine SDF-1 foi associado ao atraso no início dos sintomas relacionados com a SIDA (Winkler et al. 1998). Outros genes do sistema imunitário, como os do sistema HLA, parecem também influenciar a progressão da doença, embora os efeitos sejam complexos e possam depender de interações com outros genes hospedeiros (McNicholl et al. 1997)., Foram demonstradas respostas imunitárias celulares específicas, particularmente mediadas por células T citotóxicas ou respostas humorais ao nível das mucosas, em indivíduos seronegativos expostos (Mazzoli et al. 1997), indicando que a imunidade adquirida pode ser o mecanismo responsável para controlar a infecção nestes indivíduos. A importância relativa destes mecanismos em populações com diferentes modos de exposição ou de origem genética precisa ser elucidado
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Fig. | Tabela I | Tabela II Tabela III Tabela IV
Este trabalho recebeu apoio financeiro da Universidade de Antioquia e o Banco de la Republica.
+autor correspondente. Fax: + 57-4 510 6062. E-mail: [email protected].,co
Received 26 August 1999
Accepted 4 January 2000
