a capacidade de conceber, construir e executar ensaios específicos, sensíveis e robustos é crucial em todas as áreas da investigação biomédica. A título de exemplo, em aplicações de investigação básica pode ser necessário quantificar os níveis celulares de uma determinada proteína, determinar os níveis de um metabolito no soro ou urina ou, talvez, comparar a actividade catalítica de uma enzima no tecido normal e doente ., Nos ensaios das indústrias farmacêutica e biotecnológica são necessários para a identificação e caracterização de potenciais novas moléculas de medicamentos . Outros estudos podem exigir a medição quantitativa dos níveis de expressão genética . independentemente da aplicação específica ou da molécula a medir, deve considerar-se um certo número de factores fundamentais no desenvolvimento de um doseamento biológico., É importante que se preste muita atenção não só ao próprio ensaio, mas também a todo o fluxo de trabalho que precisa de ser desenvolvido desde a preparação da amostra até à análise da qualidade dos dados fornecidos pelo ensaio. Os principais aspectos do desenvolvimento do doseamento discutidos neste artigo são de aplicabilidade geral. São válidos independentemente do tipo de ensaio a ser desenvolvido (e.g.,, ensaios à base de anticorpos, tais como ELISA e electrochemiluminescência, determinação da concentração total de proteínas/proteínas, ensaios de actividade enzimática, ensaios à base de células ou PCR quantitativo, ou ensaio especializado, tais como o ensaio de activação por molécula única ). Do mesmo modo, os aspectos-chave são válidos independentemente do sistema de detecção utilizado, quer se baseie em absorvância, fluorescência, radioactividade ou mesmo espectrometria de massa., Cada ensaio específico terá suas próprias idiossincrasias, mas ao prestar atenção cuidadosa aos pontos discutidos abaixo, o pesquisador pode ajudar a garantir que eles desenvolvam um ensaio robusto, confiável, adequado para o propósito. Muitas vezes, existem diretrizes e/ou extensas discussões sobre o desenvolvimento doseamento usando tecnologias específicas, tais como aquelas para medições direcionadas de peptidos espectrometria de massa . Embora se centre nas questões específicas dos ensaios de EM específicos, alguns dos pontos de discussão são relevantes para qualquer projecto de desenvolvimento do ensaio., Em particular, os autores salientam a necessidade de adoptar uma abordagem adequada ao desenvolvimento e validação dos ensaios . Testes complexos baseados em células que visam imitar o ambiente celular in vivo estão desempenhando um papel crescente na descoberta e desenvolvimento de drogas. Embora os detalhes específicos de tais ensaios estejam fora do âmbito deste artigo, é importante enfatizar que os princípios básicos do desenvolvimento dos ensaios devem ser respeitados, a fim de construir ensaios robustos e confiáveis que gerem dados significativos .,estão disponíveis kits de desenvolvimento comercial para facilitar o estabelecimento doseamento. Por exemplo, Stadtmauer EA et al utilizou o Kit De Reagente auxiliar do DuoSet a partir de R&d sistemas para estabelecer um teste ELISA detectando proteína residual Cas9 em células T projetadas por CRISPR . As organizações comerciais desenvolveram uma vasta gama de ensaios, devendo antes de empreender o esforço para desenvolver um novo ensaio. Os testes de amostra incluem o teste de angiogénese magnética do Ratinho MILLIPORESIGMA baseado no mapa de MILLIPLEX ., aspectos-chave Considerações relativas à molécula de interesse ao iniciar um projecto de desenvolvimento do ensaio, o investigador deve fazer uma série de perguntas a fim de definir os requisitos exactos do ensaio.
| Pergunta | Pontos a considerar |
|---|---|
| o Que é a exata molécula para ser analisado?total ou modificado (por exemplo, fosforilado / acetilado / metilado)?solúvel ou ligado à membrana?parâmetro de ensaio?,quantidade de molécula presente?função biológica?fonte da molécula?disponibilidade da amostra Volume da amostra provável concentração da molécula estabilidade da molécula quantitativa ou semi-quantitativa? | a medição semiquantitativa da molécula é suficiente, ou o estudo requer quantificação rigorosa?número de pontos a executar?10s, 100s, 1000s? model-to-data streamlining Automation |
Quadro 1., A molécula a ser avaliada
o ponto de partida deve ser absolutamente claro sobre qual molécula e exatamente qual a propriedade dessa molécula deve ser medida. Isto pode parecer óbvio, mas é uma questão de importância fundamental e sustenta todas as actividades subsequentes de desenvolvimento dos ensaios. Por exemplo, o pesquisador deseja medir a quantidade total de uma determinada proteína em um lisado celular ou apenas a forma fosforilada, ou tanto a proteína total e fosforilada ?, Do mesmo modo, o estudo pode determinar a necessidade de medir isoformas ou variantes da proteína em causa . No caso de uma proteína, é necessário esclarecer se o parâmetro fundamental a medir é a quantidade da proteína presente ou sua função biológica, como a atividade enzimática ou o efeito de uma citocina em potenciais alvos celulares. Em alternativa, pode ser aceitável ou desejável medir o nível de expressão genética ao nível do ARNm., Pode ser que o estudo determine que testes separados sejam desenvolvidos para medir a expressão do gene, os níveis de proteínas no estado estacionário e a função biológica, respectivamente ; cada ensaio irá gerar informações diferentes mas complementares sobre a molécula de interesse.
é importante considerar a fonte da molécula que deve ser avaliada. A molécula deve ser medida num fluido corporal, como soro ou urina? A molécula deve ser medida num órgão obtido de um animal experimental ou numa amostra de biopsia de um doente?, Talvez o material de origem seja tecido post mortem. Pode ser que a fonte seja a cultura de células in vitro, caso em que uma consideração importante é se estas serão escassas células primárias ou uma linha celular imortalizada facilmente escalável.
a fonte da molécula determinará a quantidade e Disponibilidade da amostra. Determina também a concentração da molécula de interesse e pode influenciar profundamente a sua estabilidade, como discutido nas secções seguintes., Assim, é provável que a fonte da molécula de interesse tenha uma influência significativa no fluxo de trabalho global do ensaio que é, em última análise, desenvolvido.estabilidade
também é importante compreender a estabilidade da molécula para a qual o ensaio deve ser desenvolvido. É relativamente estável, ou é extremamente instável exigir que sejam tomadas precauções especiais durante a recolha e preparação da amostra para o ensaio, a fim de obter dados significativos do ensaio?, Mesmo as moléculas que são estáveis na forma isolada podem ser instáveis no complexo meio biológico das amostras a serem avaliadas onde podem estar sujeitas a oxidação, proteólise ou a perda de modificações pós-translacionais. Pode, por exemplo, ser necessário incluir agentes redutores ou inibidores da protease e/ou da fosfatase em tampões de amostra para manter moléculas nas suas formas fisiologicamente relevantes, tanto durante a preparação da amostra como durante o próprio ensaio., A fonte da molécula é uma consideração importante aqui; uma molécula que é estável em, digamos, soro pode se revelar extremamente instável em um homogeneizado de fígado. Se assaying biopsia ou tecido post-mortem é importante saber como o tecido foi manuseado e armazenado, uma vez que isso pode afetar profundamente tanto a quantidade e qualidade de certas moléculas.,
a fim de desenvolver um ensaio adequado ao fim a que se destina, é importante decidir desde o início se uma medição semiquantitativa da molécula, como a Western blot, cumpre os requisitos do projecto ou se é necessário um ensaio rigorosamente quantitativo.
é igualmente importante considerar quantas amostras terão de ser avaliadas. Se apenas um punhado de amostras for avaliado, pode ser perfeitamente aceitável um formato de ensaio manual em várias etapas, com grande intensidade de mão-de-obra., Inversamente, se milhares ou dezenas de milhares de ensaios devem ser executados, talvez como parte de um exercício composto de análise de perfis, será importante simplificar, racionalizar e automatizar o processo de teste tanto quanto os recursos do laboratório permitem, Com, por exemplo, um formato como microarray. Entretanto, arrays trazem seu próprio conjunto de problemas, como a variação espacial intra-assay .,
As respostas a todas estas questões relacionadas com a molécula a ser avaliada desempenharão um papel fundamental ao ajudar o investigador a decidir sobre o formato mais adequado para as suas necessidades específicas, e devem ser tidas em conta ao considerar os fundamentos do ensaio discutidos na secção seguinte.tendo considerado que estas questões relativas à molécula devem ser analisadas, deve ser prestada especial atenção a uma série de questões técnicas/práticas fundamentais que se aplicam independentemente da molécula de interesse ou do formato específico adoptado.,
| Ensaio parâmetro | considerações-Chave |
|---|---|
| Especificidade | Será que o ensaio de detectar somente o desejado molécula?sensibilidade |
| sensibilidade | o ensaio detectará os níveis da molécula nas amostras de interesse? |
| gama dinâmica | os níveis da molécula situar-se-ão dentro da gama dinâmica do ensaio?os Componentes da amostra do ensaio irão interferir com o ensaio?,pode o ensaio lidar com pequenas alterações na amostra do ensaio/equipamento/operador?o ensaio apresenta uma baixa variabilidade inter e intra-doseamento?o ensaio é capaz de determinar com precisão a quantidade/concentração absoluta da molécula?é apropriado / desejável analisar estatisticamente o desempenho do ensaio?o ensaio tem suficiente poder de discriminação?, |
Tabela 2. Uma consideração absolutamente fundamental é a especificidade do ensaio. Tendo decidido exatamente que molécula e parâmetro dessa molécula deve ser medido, o pesquisador precisa estabelecer que o ensaio irá medir apenas o que eles querem que ele medir e não qualquer outra coisa., Se se verificar que o ensaio está a medir tanto a molécula desejada como outras moléculas, então é possível que se possam tomar medidas para melhorar a especificidade do ensaio. devem ser considerados dois aspectos sobrepostos da especificidade do doseamento. em primeiro lugar, os reagentes de detecção primária são adequadamente específicos? Por exemplo, no caso do ensaio baseado em HPLC, quão confiante é o Pesquisador de que um pico identificado num determinado tempo de retenção é a molécula de interesse e não uma molécula diferente que acontece apenas Co-eluir com a molécula de interesse., Aqui deve ser considerada a fonte do analito. A análise das amostras de urina pode não dar origem a picos que co-eluem com a molécula de interesse. Contudo, o mesmo pode não ser verdade para as amostras de soro ou de tecidos homogeneizados analisadas no mesmo ensaio. Num ensaio à base de anticorpos, o anticorpo utilizado é absolutamente específico para a proteína-alvo ou também reage cruzada com outras proteínas?, É possível obter anticorpos que são específicos para uma determinada proteína ou uma modificação pós-translacional particular, tais como fosforilação em um local específico ou para um neo-epítopo gerado após clivagem por uma proteinase . Muitas vezes, é desejado um anticorpo com maior afinidade . Esses reagentes de anticorpos devem ser caracterizados rigorosamente nas condições reais do ensaio, a fim de garantir a especificidade desejada, reagindo apenas com o produto desejado e não com a molécula substrato/precursor., Em ensaios que não utilizam a detecção de anticorpos, tais como um doseamento de clivagem peptídica fluorogénica, o grau de especificidade será muito mais baixo. Em vez de clivagem em um local específico gerando um sinal, clivagem em qualquer local dentro do peptídeo irá agora dar origem a um sinal. isto leva-nos ao segundo aspecto da especificidade do doseamento e constitui um problema particular para os ensaios enzimáticos in vitro., Mesmo que os reagentes de deteção sejam específicos para um evento específico que se pretende testar, pode muito bem ser que em um lisato de células brutas ou homogeneizado de tecidos que múltiplas enzimas são capazes de realizar o mesmo evento (por exemplo, fosforilação, clivagem proteolítica ou outra modificação pós-translacional). Este problema será ainda maior no caso do exemplo do ensaio de clivagem do peptídeo fluorogénico acima referido., O problema da sobreposição múltipla de actividades em lisatos brutos pode muitas vezes ser superado pela inclusão de uma fase adicional de preparação da amostra, como uma imuno-precipitação específica, a fim de alcançar a especificidade desejada do doseamento . Alternativamente, dependendo da natureza do estudo, a melhor solução pode ser executar o ensaio de actividade utilizando uma enzima altamente purificada (nativa ou recombinante). qual a sensibilidade do ensaio? Este valor será determinado tanto pelos níveis da molécula de interesse na amostra como pelo volume da amostra disponível., O ponto importante é que o ensaio deve ser suficientemente sensível para que o nível da molécula se situe bem dentro da gama dinâmica do ensaio (ver abaixo). Esta é uma consideração importante ao decidir sobre o formato do ensaio e o sistema de detecção. Se for necessária uma grande sensibilidade, então uma fluorescência, em vez de absorvência, a leitura é mais provável de dar a sensibilidade desejada. A sensibilidade Pode também ser aumentada utilizando a amplificação enzimática do sinal original ., Estes sistemas de ensaio “acoplados” podem ser extremamente sensíveis, mas também proporcionam maior oportunidade para a amostra de ensaio interferir com o ensaio (ver abaixo).
é importante determinar a gama dinâmica do ensaio. Por outras palavras, o intervalo em que a leitura do ensaio é proporcional à quantidade de molécula-alvo na amostra a analisar., No caso de um ensaio para medir a concentração de uma molécula, é importante que o ensaio (independentemente do formato adotado) é devidamente calibrado pela construção de uma curva de calibração, tais como o exemplo hipotético da Figura 1. Do mesmo modo, no caso de um doseamento enzimático, é necessário assegurar que o doseamento funciona num intervalo tal que a taxa inicial da reacção seja medida e que a taxa medida seja proporcional à quantidade de enzima adicionada ao doseamento., Para se manter dentro da gama dinâmica do ensaio (algumas), As amostras podem precisar de ser diluídas ou concentradas. Este pode ser um problema particular se a molécula de interesse está presente em níveis vastamente diferentes em diferentes amostras. A incapacidade de se manter dentro da gama dinâmica do ensaio resultará na geração de dados espúrios. Os intervalos dinâmicos devem também ser testados in vivo, se o ensaio se destinar a ser utilizado in vivo, por exemplo, utilizando linhas celulares que expressem um alvo de anticorpos a diferentes níveis para o desenvolvimento de um ensaio IHC .,
em ensaios com acoplamentos enzimáticos (quer se trate de ensaios de actividade enzimática ou de metabolitos) é essencial determinar que as enzimas de acoplamento não medem inadvertidamente nenhum componente da amostra que não seja a molécula de interesse., Se esses ensaios forem utilizados para o rastreio ou caracterização de compostos, é importante assegurar que o ensaio seja configurado de modo a medir a inibição da enzima-alvo e não da(s) enzima (s) de engate . Caso se suspeite de interferência significativa dos componentes da amostra do ensaio, devem ser tidas em conta as fases tais como precipitação (imuno) ou purificação parcial, a fim de remover esses componentes . O ponto-chave é, independentemente do formato do ensaio adoptado, estar alerta para potenciais fontes de interferência e formas de eliminar ou minimizar o seu impacto no ensaio., Não se deve partir do princípio de que um ensaio desenvolvido para medir uma molécula num determinado tipo de tecido/célula/fluido biológico se irá realizar de forma aceitável quando o ensaio for realizado em amostras de uma fonte diferente; o ensaio terá de ser reavaliado para a nova fonte de amostra.a fim de fornecer dados fiáveis e utilizáveis, o ensaio deve ser robusto e reprodutível. O ensaio deve ser robusto, na medida em que não seja indevidamente afectado por alterações na preparação e manuseamento das amostras., Do mesmo modo, deve dar os mesmos resultados independentemente do indivíduo que efectua o ensaio. O ensaio deve ser altamente reprodutível (também designado por precisão) de modo a que o grau de variação seja tão reduzido quanto possível, tanto no que se refere ao ensaio intra como inter. Num ensaio único, os replicados de uma amostra padrão e de uma amostra “real” devem apresentar valores muito semelhantes, respectivamente. Do mesmo modo, deve haver pouca variação diária nos valores obtidos do ensaio.,
Se o ensaio for para medir a quantidade absoluta (e não relativa) de uma molécula, deve ser calibrado (ver acima) contra um padrão aceite, a fim de se obter uma quantificação precisa. Por vezes, o fluxo de trabalho do ensaio exige um trabalho significativo da amostra (por exemplo, concentração, remoção de componentes interferentes da amostra, etc.)..) para que a molécula de interesse possa ser medida de forma confiável. Em tais casos, é altamente desejável incluir um padrão interno para corrigir as perdas de analitos ao longo do fluxo de trabalho do ensaio., Por exemplo, no caso dos ensaios em, o extracto a ser ensaiado pode ser “enriquecido” com uma quantidade conhecida de isótopo estável da molécula de interesse. Para um ensaio de HPLC, o padrão interno pode ser um composto estruturalmente relacionado com a molécula de interesse e que não está de outro modo presente na amostra de ensaio. A utilização de uma norma interna é particularmente importante se forem necessários dados quantitativos muito precisos e precisos .,os níveis de robustez, reprodutibilidade e precisão aceitáveis dependem do objectivo do ensaio e devem ser decididos pelo investigador para a sua utilização corrente específica.
Supondo uma distribuição Gaussiana, dois resultados, a média das quais diferem por > 2 desvios padrão (SD) são considerados estatisticamente significativamente diferentes a 95% de nível de confiança., Dois resultados similarmente diferentes por >3 SD são considerados estatisticamente significativamente diferentes no nível de confiança de 99,7%. Assim, quanto maior for a reprodutibilidade (precisão) do ensaio e, por conseguinte, quanto menor for o desvio-padrão das leituras experimentais, maior será a discriminação do ensaio.
os ensaios de alto débito utilizados na descoberta de drogas utilizam frequentemente repórteres fluorescentes e luminescentes para permitir que um grande número de ensaios seja realizado de forma automatizada., No entanto, com o desenvolvimento de novas tecnologias, há um interesse crescente no uso de ensaios celulares livres de etiquetas que utilizam métodos de detecção Biofísica . Já estão disponíveis comercialmente vários instrumentos para ensaios sem etiquetas . É importante que os ensaios sem etiquetas evitem o potencial de artefactos causados pela presença do sistema de relatórios. Por exemplo , a molécula de repórter bioluminescente vulgarmente utilizada firefly luciferina é ela própria um agonista parcial do GPR35, complicando assim potencialmente a interpretação dos dados compostos/farmacológicos., Um benefício adicional dos ensaios sem rótulo é o facto de permitirem o rastreio de compostos contra os níveis endógenos de receptores nas células primárias e nas células estaminais relevantes para a doença .podem também ocorrer interacções inesperadas com compostos de relato em ensaios bioquímicos (para além das questões de atenuação e autofluorescência discutidas acima). Por exemplo, uma série de compostos mostrados para ativar a atividade da proteína deacetilase do SIRT1 usando um substrato peptídico marcado com TAMRA não teve atividade em ensaios enzimáticos usando uma versão não marcada do mesmo peptídeo ou um substrato proteico nativo de comprimento completo., A activação observada com o substrato marcado com TAMRA foi um artefacto devido a uma interacção física directa dos compostos com o TAMRA fluoróforo .
assim, ao projetar e validar testes para fins de triagem/análise de compostos, é importante considerar o potencial para interações composto-repórter. Os potenciais benefícios da utilização de um ensaio sem rótulo em algum momento da cascata de triagem devem ser seriamente considerados.
