The growth and maintenance of micróbios on agar-containing media in Petri lowses has long been a common practice in microbiology. Tradicionalmente, o método preferido para a análise quantitativa da população de culturas puras e mistas baseia-se no revestimento de diluições em série e subsequente Contagem de unidades formadoras de colónias (CFUs)., Nos últimos anos, uma série de métodos alternativos de alta produção (HT), baseados em PCR quantitativo (Neeley et al. 2005; Haarman and Knol 2006), fluorescent labelling (Blasco et al. 2003; Lay et al. 2005) ou análise do genoma com micro matrizes (Bae et al. 2005) ganharam popularidade (Liu et al. 2004a). No entanto, a maioria destes métodos mede diferentes entidades, ou seja, todas as células, incluindo as células não viáveis. Além disso, estes métodos podem exigir a utilização de equipamento especial ou o desenvolvimento extenso de protocolos., Além disso, alguns destes métodos são pouco compatíveis com substratos complexos e amostras ambientais. Isso explica em grande parte por que a enumeração de micróbios por Contagem de colônias ainda é uma metodologia amplamente aplicada. Atualmente, a microbiologia está cada vez mais se movendo para análises de TH, o que pode exigir o uso de grandes quantidades de placas. Isso resulta em sérios inconvenientes ao usar técnicas convencionais de revestimento e contagem de colônias. A preparação dos meios de comunicação e das placas, bem como a contagem das Colónias, é demorada e intensiva em termos de mão‐de‐obra., Além disso, grandes volumes podem conduzir a custos significativos, em especial quando são utilizados substratos de indicadores ou de reporter dispendiosos. Finalmente, muitos métodos consomem grandes quantidades de materiais, incluindo descartáveis, comprometendo a sua sustentabilidade. vários relatórios descrevem tecnologias de revestimento alternativas em que os volumes necessários são reduzidos (Jett et al. 1997; McNulty and Dunn 1999; Tornero and Dangl 2001; Hamilton et al. 2002) ou o processo de contagem de colónias é automatizado (Marotz et al. 2001; Dahle et al. 2004; Putman et al. 2005)., No entanto, estes exemplos requerem equipamento que não está presente em laboratórios de Microbiologia padrão (Gilchrist et al. 1973; Liu et al. 2004b), pode resultar apenas em redução limitada (Gilchrist et al. 1973; Jett et al. 1997; Hamilton et al. Em 2002), ou são pouco adequados para a automação (McNulty e Dunn 1999; Hamilton et al. 2002). Com base neste trabalho, relatamos um método simples e flexível para determinar contagens de células capitalizando em formatos de placas de microtítulo., Integra placas miniaturizadas rápidas e contagem (semi) automatizada de minicolonias permitindo uma redução de 100 vezes do processo em comparação com os procedimentos convencionais de contagem de UFC. Ele pode ser totalmente operado com pouco mais do que uma pipeta multicanal, uma câmera digital e ImageJ, um pacote de processamento de imagem que está disponível como freeware (http://rsb.info.nih.gov/ij/). São apresentados vários exemplos para ilustrar o poder da abordagem para a rápida avaliação de contagens viáveis de importantes Microrganismos Industriais procarióticos e eucarióticos.,
para revestimento, nós usamos 10 vezes diluições seriais que foram preparadas em micro placas de 96 poços usando uma pipeta Genex Alfa de 12 canais (Genex Labs, Torquay, Reino Unido). Para cada diluição, pipetaram‐se amostras de cinco µl sobre um meio de ágar contendo placas utilizando a mesma pipeta. Tipicamente, 60 a 120 gotículas foram aplicadas por placa quadrada de 12 cm. As placas eram secas ao ar e, em seguida, incubadas até que as colônias eram visíveis com um tamanho médio de 200-500 µm. Posteriormente, essas minicolonias foram fotografadas com uma câmera digital de alta resolução Canon EOS 350D (Canon 0020X665; Canon Inc.,, Japão) equipado com uma lente de macro Sigma 105 mm (AF 105MM F2·8 EX MACRO F; Sigma Corporation, Japão). Placas foram colocadas em uma superfície preta e iluminadas a partir do lado, a fim de alcançar um grande contraste entre colônias e fundo.
imagens digitais foram processadas no ImageJ usando um plug-in recentemente desenvolvido que pode ser baixado como informação de suporte. O processo de contagem é representado esquematicamente na Fig. S1. Brevemente, as imagens a cores foram convertidas em tons de cinzento de 8 bits e invertidas., Por intervenção manual usando a função ‘threshold’ do ImageJ; colônias foram selecionadas do fundo. Então todas as fotos foram empilhadas. Após inversão, a mediana foi retirada de cada pixel com seus pixels vizinhos para redução de ruído. A função “divisor de águas” foi utilizada para separar as colónias fundidas e a função “analisar partículas” foi utilizada para a contagem. A saída foi salva como um arquivo de texto e posteriormente processada no Microsoft Excel., no nosso estudo, visámos especificamente desenvolver protocolos rápidos de contagem de UFC para micróbios industriais, incluindo bactérias lácticas, Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae. Quando estas estirpes são enumeradas por Contagem de UFC convencional, normalmente entre 30 e 300 colónias por placa padrão de Petri de ágar de 8 cm de diâmetro resulta numa contagem óptima. Números maiores podem facilmente resultar em subestimação, já que colônias individuais não podem ser discriminadas., O baixo número de colônias por placa resulta em grandes desvios padrão, que é a raiz quadrada da média na distribuição de Poisson. Isto implica que, no caso de serem contadas cinco colónias, o número de células nas amostras platinadas se situa entre 1 e 9, com 95% de confiança, enquanto para 100 células estes valores se situam entre 80 e 120. Neste último caso, o intervalo de confiança de 95% é um desvio de 20% da média. Por conseguinte, pretendíamos desenvolver um protocolo que permitisse a contagem de pelo menos 100 colónias., Isto implica que, em qualquer processo de redução da contagem de placas, é crucial aumentar o número de colônias que podem ser contadas por cm2 de superfície de ágar. Em nossas experiências, isso foi conseguido contando minicolonias com um tamanho de 200-500 µm. Portanto, as colônias foram contadas assim que as minicolonias são visíveis, o que é mais cedo do que normalmente é feito com a contagem convencional. Além disso, o crescimento de muitas colônias em uma área de superfície relativamente pequena resulta em colônias menores, por exemplo, devido à disponibilidade limitada de substrato (Liu et al. 2004b)., Isso efetivamente aumenta o número de colônias que podem ser contadas por cm2 de superfície de ágar. usámos os procedimentos descritos acima para efectuar uma contagem viável de vários microrganismos industriais e estes dados foram marcados em banco de dados para procedimentos de contagem convencionais. Portanto, Streptococcus thermophilus CNRZ1066, Lactococcus lactis MG1363, Lact. plantarum WCFS1, E. coli DH5a e S. cerevisiae CBS57957 foram cultivadas em meios adequados (Quadro 1) durante aproximadamente 24 horas a 37°C. foram preparadas diluições de Cultura em placas de 96 alvéolos em 12 vezes e estas foram revestidas utilizando ambos os métodos., Para o método convencional, foram pipetadas 50 µl de amostras numa placa de ágar redonda de 8 cm de diâmetro com uma pipetman P100 Gilson e espalhadas com um esfregaço de vidro. As contagens médias das UFC foram comparáveis e os desvios-padrão comparáveis ou inferiores ao método da minicolonia que confirma a adequação do método à contagem rápida das UFC. A partir dos desvios-padrão do Quadro 1, pode concluir-se que a sensibilidade do método fast é comparável ao método convencional, embora a variação entre contagens possa diferir com o tipo de pipetas utilizado, como anteriormente alegado por Jett et al., (1997). por exemplo, Lact. as manchas plantarum contendo minicolonias tinham cerca de 9 mm de diâmetro e, portanto, é possível contar até 200 colônias por cm2 de forma eficiente em ágar MRS‐galactose, que normalmente é de uma a duas ordens de magnitude maior do que com o revestimento convencional. Descobrimos que os tamanhos das manchas e minicolonias podem variar com o tipo de meio de ágar, tempo de secagem, matrice da amostra e espécies de interesse (não mostrado)., Pode afectar o número de colónias que podem ser enumeradas por 5 µl de ponto, tipicamente na gama entre 10 e 150, mas não no número de colónias que podem ser contadas por cm2 para esta espécie. O limite de detecção do método de minicolonia é semelhante ao do método convencional. O intervalo dinâmico do novo método foi encontrado igual ao método convencional (dados não mostrados). nos últimos anos, foram desenvolvidas alternativas e variantes HT para muitas técnicas microbiológicas convencionais., Os melhores exemplos são, provavelmente, as cultivações em lotes líquidos para as quais várias alternativas Multi‐bem pertencem ao equipamento de laboratório padrão agora‐a‐dias. Também são relatadas várias alternativas de HT para a contagem de UFC (Dahle et al. 2004; Liu et al. 2004b; Putman et al. 2005). As quantidades produzidas são aumentadas, concentrando-se quer na automatização do processo de contagem, quer na miniaturização do próprio revestimento., A novidade do método aqui relatado depende da integração destes aspectos, enquanto requer apenas Equipamento de laboratório padrão, uma câmera digital, software de imagem que está disponível como freeware, e um plug‐in dedicado que está disponível como Material suplementar para este papel. O protocolo de revestimento e contagem rápida resultante é adequado para uma determinação rápida de contagens de células viáveis. O método é altamente flexível, pois pode ser facilmente implementado para diferentes espécies microbianas e é fácil de usar., Devido à sua miniaturização, reduz a quantidade de materiais necessários em cerca de 100 vezes, o que a torna uma alternativa eficiente em termos de custos e mão‐de‐obra para os métodos convencionais. Como a contagem é parcialmente automatizada, o usuário pode monitorar os passos críticos na aquisição e processamento de dados sem a variabilidade encontrada a partir da contagem manual de CFUs (Lumley et al. 1997). Antecipamos que este protocolo é uma ferramenta valiosa para a enumeração rotineira de micróbios industriais em laboratórios de pesquisa e controle de qualidade.
