las interacciones de la glicoproteína de la envoltura en el ensamblaje del coronavirus

los coronavirus se ensamblan brotando en membranas lisas del compartimento intermedio ER-a-Golgi. Hemos estudiado la Asociación de las glicoproteínas de membrana viral M Y S en la formación de la envoltura de viriones. Mediante el análisis de coinmunoprecipitación, se demostró que las proteínas M Y S del virus de la hepatitis de ratón (MHV) interactúan específicamente formando complejos heteromultiméricos en células infectadas., Estos solo pudieron detectarse cuando se seleccionaron cuidadosamente los detergentes utilizados para su solubilización a partir de células o viriones: una combinación de detergentes no iónicos (NP-40) e iónicos (ácido desoxicólico) demostró ser óptima. Los experimentos de persecución de pulso revelaron que las proteínas M Y S recién hechas participan en la formación compleja con diferentes cinéticas. Mientras que la proteína M apareció en complejos inmediatamente después de su síntesis, la proteína S recién sintetizada lo hizo solo después de una fase de retraso de > 20 min., La M recién hecha se incorporó a partículas virales más rápido que la S, lo que sugiere que se asocia con moléculas preexistentes de S. Utilizando la coexpresión de M Y S impulsada por el virus vaccinia T7, también demostramos la formación de complejos M/S en ausencia de otras proteínas coronavirales. Las etiquetas de persecución de pulso y los análisis de coinmunoprecipitación revelaron que M y S se asocian en las membranas pre-Golgi porque la forma no glicosilada de M apareció rápidamente en los complejos M/S., Dado que no se detectó ninguna asociación de M Y S cuando la exportación de proteínas de la sala de emergencias fue bloqueada por brefeldin A, los complejos estables más probables surgen en el compartimiento intermedio de la sala de emergencias a Golgi. El análisis del gradiente de velocidad de la sacarosa mostró que los complejos M/S son heterogéneos y de orden superior, lo que sugiere que se mantienen por interacciones homo y heterotípicas. Complejos M / S colocados con alfa-manosidasa II, una proteína Golgi residente. Adquirieron modificaciones oligosacáridas específicas de Golgi, pero no se detectaron en la superficie celular., Así, la proteína S, que sobre sí misma fue transportada a la membrana plasmática, fue retenida en el complejo de Golgi por su asociación con la proteína M. Debido a que los coronavirus brotan en las membranas pre-Golgi, este resultado implica que los complejos de glicoproteínas de la envoltura no determinan el sitio de brotación. Sin embargo, la auto-asociación de las glicoproteínas de la envoltura MHV en complejos de orden superior es indicativa de su papel en la clasificación de las proteínas de la membrana viral y en la conducción de la formación de la cubierta de lipoproteínas virales en el ensamblaje del virus.