La crescita e il mantenimento di microbi su supporti contenenti agar nelle piastre di Petri è stata a lungo una pratica comune in microbiologia. Tradizionalmente, il metodo preferito per l’analisi quantitativa della popolazione di colture pure e miste si basa sulla placcatura delle diluizioni seriali e sul successivo conteggio delle unità formanti colonie (CFU)., Negli ultimi anni una serie di metodi alternativi, high‐throughput (HT), basati sulla PCR quantitativa (Neeley et al. 2005; Haarman e Knol 2006), etichettatura fluorescente (Blasco et al. 2003; Lay et al. 2005) o sondaggio del genoma con micro array (Bae et al. 2005) hanno guadagnato popolarità (Liu et al. 2004 bis). Tuttavia, la maggior parte di questi metodi misura entità diverse, cioè tutte le celle, incluse le celle non vitali. Inoltre, questi metodi possono richiedere l’uso di attrezzature speciali o lo sviluppo di protocolli estesi., Inoltre, alcuni di questi metodi sono scarsamente compatibili con substrati complessi e campioni ambientali. Ciò spiega in gran parte perché l’enumerazione dei microbi mediante conteggio delle colonie è ancora una metodologia ampiamente applicata. Attualmente, la microbiologia si sta muovendo sempre più verso le analisi HT, che possono richiedere l’uso di grandi quantità di lastre. Ciò si traduce in gravi inconvenienti quando si utilizzano tecniche convenzionali di placcatura e conteggio delle colonie. La preparazione di supporti e lastre, nonché il conteggio delle colonie, richiede molto tempo e richiede molto lavoro., Inoltre, grandi volumi possono comportare costi significativi, in particolare quando vengono utilizzati costosi substrati indicatori o reporter. Infine, molti metodi consumano grandi quantità di materiali tra cui monouso, compromettendo la loro sostenibilità.
Diversi rapporti descrivono tecnologie di placcatura alternative in cui i volumi richiesti sono ridimensionati (Jett et al. 1997; McNulty e Dunn 1999; Tornero e Dangl 2001; Hamilton et al. 2002) o il processo di conteggio delle colonie è automatizzato (Marotz et al. 2001; Dahle et al. 2004; Putman et al. 2005)., Tuttavia, questi esempi richiedono attrezzature che non sono presenti nei laboratori di microbiologia standard (Gilchrist et al. 1973; Liu et al. 2004b), può comportare solo un downscaling limitato (Gilchrist et al. 1973; Jett et al. 1997; Hamilton et al. 2002), o sono poco adatti per l’automazione (McNulty e Dunn 1999; Hamilton et al. 2002). Sulla base di questo lavoro, riportiamo un metodo semplice e flessibile per determinare il conteggio delle celle capitalizzando sui formati di piastre di microtitolazione., Integra la placcatura miniaturizzata rapida e il conteggio (semi‐) automatizzato delle minicolonie consentendo un downscaling 100 volte del processo rispetto alle procedure di conteggio CFU convenzionali. Può essere completamente utilizzato con poco più di una pipetta multicanale, una fotocamera digitale e ImageJ, un pacchetto di elaborazione delle immagini disponibile come freeware (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Alcuni esempi sono presentati per illustrare la potenza dell’approccio per la valutazione rapida dei conteggi vitali di importanti microrganismi industriali procarioti ed eucarioti.,
Per la placcatura, abbiamo usato diluizioni seriali di 10 volte che sono state preparate in micro piastre a 96 pozzetti utilizzando una pipetta Genex Alpha a 12 canali (Genex Labs, Torquay, UK). Per ogni diluizione, campioni di cinque µl sono stati pipettati su un mezzo di agar contenente piastre utilizzando la stessa pipetta. Tipicamente, sono state applicate da 60 a 120 goccioline per piastra quadrata di 12 cm. Le piastre sono state essiccate all’aria e quindi incubate fino a quando le colonie erano visibili con una dimensione media di 200-500 µm. Successivamente, queste minicolonie sono state fotografate con una fotocamera digitale ad alta risoluzione Canon EOS 350D (Canon 0020X665; Canon Inc.,, Giappone) dotato di un obiettivo macro Sigma 105 mm (AF 105MM F2 * 8 EX MACRO F; Sigma Corporation, Giappone). Le piastre sono state messe su una superficie nera e illuminate di lato per ottenere un grande contrasto tra colonie e sfondo.
Le immagini digitali sono state ulteriormente elaborate in ImageJ utilizzando un plug‐in di nuova concezione che può essere scaricato come informazioni di supporto. Il processo di conteggio è rappresentato schematicamente in Fig. S1. In breve, le immagini a colori sono state convertite in scala di grigi a 8 bit e invertite., Con l’intervento manuale utilizzando la funzione ‘soglia’ di ImageJ; le colonie sono state selezionate dallo sfondo. Quindi tutte le immagini sono state impilate. Dopo l’inversione, la mediana è stata presa da ciascun pixel con i pixel vicini per la riduzione del rumore. La funzione “spartiacque” è stata utilizzata per separare le colonie unite e la funzione “analizza particelle” è stata utilizzata per il conteggio. L’output è stato salvato come file di testo e successivamente elaborato in Microsoft Excel.,
Nel nostro studio, abbiamo specificamente mirato a sviluppare protocolli di conteggio CFU veloci per microbi industriali tra cui batteri lattici, Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae. Quando questi ceppi sono enumerati dal conteggio CFU convenzionale, tipicamente tra 30 e 300 colonie per capsula di Petri agar standard di 8 cm di diametro si ottiene un conteggio ottimale. Numeri più grandi possono facilmente provocare sottovalutazione come singole colonie non possono essere discriminati., Un basso numero di colonie per piastra provoca grandi deviazioni standard, che è la radice quadrata della media nella distribuzione di Poisson. Ciò implica che nel caso in cui si contino cinque colonie il numero di cellule nei campioni placcati è compreso tra 1 e 9 con una confidenza del 95% mentre per 100 cellule questi valori sono 80 e 120. In quest’ultimo caso, l’intervallo di confidenza del 95% è una deviazione del 20% della media. Abbiamo quindi mirato a sviluppare un protocollo che consentisse il conteggio di almeno 100 colonie., Ciò implica che, in qualsiasi processo di ridimensionamento del conteggio delle lastre, è fondamentale aumentare il numero di colonie che possono essere contate per cm2 di superficie di agar. Nei nostri esperimenti, questo è stato ottenuto contando le minicolonie con una dimensione di 200-500 µm. Pertanto, le colonie sono state contate non appena le minicolonie sono visibili, il che è precedente rispetto al normale conteggio convenzionale. Inoltre, la crescita di molte colonie su una superficie relativamente piccola si traduce in colonie più piccole, ad esempio a causa della limitata disponibilità di substrato (Liu et al. 2004b)., Ciò aumenta efficacemente il numero di colonie che possono essere contate per cm2 di superficie di agar.
Abbiamo utilizzato le procedure sopra descritte per eseguire il conteggio praticabile di vari microrganismi industriali e contrassegnato questi dati da banco alle procedure di conteggio convenzionali. Pertanto, Streptococcus thermophilus CNRZ1066, Lactococcus lactis MG1363, Lact. plantarum WCFS1, E. coli DH5a e S. cerevisiae CBS57957 sono stati coltivati in mezzi appropriati (Tabella 1) per circa 24 ore a 37°C. Le diluizioni di coltura sono state preparate in piastre a 96 pozzetti in 12 volte e queste sono state placcate usando entrambi i metodi., Per il metodo convenzionale, 50 µl di campioni sono stati pipettati su una piastra rotonda di agar di 8 cm di diametro con un pipetman Gilson P100 e distribuiti con un tampone di vetro. I conteggi medi di CFU erano comparabili e le deviazioni standard comparabili o inferiori con il metodo della minicolonia confermando l’idoneità del metodo per il conteggio rapido di CFU. Dalle deviazioni standard nella Tabella 1, si può concludere che la sensibilità del metodo fast è paragonabile al metodo convenzionale, sebbene la variazione tra i conteggi possa differire con il tipo di pipette utilizzate, come sostenuto in precedenza da Jett et al., (1997).
Ad esempio, Lact. le macchie plantari contenenti minicolonie avevano un diametro di circa 9 mm e quindi è possibile contare fino a 200 colonie per cm2 in modo efficiente sull’agar MRS‐galattosio, che in genere è da uno a due ordini di grandezza superiore rispetto alla placcatura convenzionale. Abbiamo scoperto che le dimensioni di macchie e minicolonie possono variare con il tipo di mezzo di agar, tempo di essiccazione, matrice campione e specie di interesse (non mostrato)., Può influenzare il numero di colonie che possono essere enumerate per 5 µl spot, tipicamente nell’intervallo tra 10 e 150, ma non il numero di colonie che possono essere contate per cm2 per questa certa specie. Il limite di rilevamento del metodo minicolonia è simile a quello del metodo convenzionale. La gamma dinamica del nuovo metodo è stata trovata uguale al metodo convenzionale (dati non mostrati).
Negli ultimi anni sono state sviluppate alternative e varianti HT per molte tecniche microbiologiche convenzionali., I migliori esempi sono probabilmente coltivazioni in lotti liquidi per i quali varie alternative multi‐well appartengono a attrezzature di laboratorio standard ora al giorno. Anche diverse alternative HT per il conteggio di CFU sono riportati (Dahle et al. 2004; Liu et al. 2004b; Putman et al. 2005). I throughput sono aumentati concentrandosi sull’automazione del processo di conteggio o sulla miniaturizzazione della placcatura stessa., La novità del metodo riportato qui si basa sull’integrazione di questi aspetti, mentre richiede solo attrezzature di laboratorio standard, una fotocamera digitale, software di imaging che è disponibile come freeware, e un plug‐in dedicato che è disponibile come materiale supplementare a questo documento. Il protocollo di placcatura e conteggio rapido risultante è adatto per una rapida determinazione dei conteggi di cellule vitali. Il metodo è altamente flessibile, perché può essere facilmente implementato per diverse specie microbiche ed è facile da usare., Grazie alla sua miniaturizzazione riduce la quantità di materiali necessari di circa 100 volte, questo lo rende un’alternativa economica e laboriosa per i metodi convenzionali. Poiché il conteggio è parzialmente automatizzato, l’utente può monitorare i passaggi critici nell’acquisizione e nell’elaborazione dei dati senza la variabilità riscontrata dal conteggio manuale delle CFU (Lumley et al. 1997). Prevediamo che questo protocollo è uno strumento prezioso per l’enumerazione di routine di microbi industriali nei laboratori di ricerca e controllo della qualità.
