Un batterio Gram-negativo, identificato come Pseudomonas aeruginosa AL98, è un potente degrader di gomma naturale e sintetica cis-1,4-poliisoprene

Abstract

Un batterio Gram-negativo, ceppo AL98, è stato isolato da un fallo di acqua all’interno di un deterioramento del pneumatico della macchina sul campo di un contadino a Münster, in Germania., Il ceppo è stato in grado di disintegrare considerevolmente la gomma naturale (NR), sia allo stato grezzo come concentrato di lattice NR o allo stato vulcanizzato come guanto di lattice NR, così come sintetico grezzo cis-1,4-poliisoprene (IR). La determinazione dell’evoluzione dell’anidride carbonica e del numero di cellule viventi durante la coltivazione in lotti con ciascuno dei materiali come unica fonte di carbonio, ha rivelato la mineralizzazione del polimero di gomma durante l’aumento della biomassa., L’indagine superficiale mediante microscopia elettronica a scansione ha dimostrato un comportamento di crescita adesiva del ceppo che procede colonizzando la superficie della gomma, fondendosi nella gomma e formando un biofilm prima della disintegrazione del materiale. La colorazione del reagente di Schiff eseguita con guanti in lattice NR indicava la produzione e l’accumulo di gruppi aldeidici durante la colonizzazione. Il substrato solido del guanto è scomparso completamente dopo un periodo di coltivazione prolungato a causa della continua degradazione., Le analisi tassonomiche del ceppo, che erano anche basate sull’esame di somiglianza del gene rRNA 16S completo, hanno rivelato la classificazione del ceppo AL98 come ceppo di Pseudomonas aeruginosa. Questo è il primo rapporto sull’isolamento di un batterio Gram-negativo che mostra forti proprietà di decomposizione della gomma.

1 Introduzione

La gomma naturale grezza (NR) per applicazioni tecniche è ottenuta come lattice dall’albero della gomma Hevea brasiliensis. Più del 90% del peso secco del lattice è costituito da cis-1,4-poliisoprene (IR) (Mw >106 Da)., Prima della conversione in prodotti in gomma subisce ulteriori lavorazioni, come la concentrazione, la masticazione e la vulcanizzazione, cioè la reticolazione delle catene polimeriche. IR può anche essere sintetizzato chimicamente migliorando così, ma non sostituendo, tutte le proprietà del prodotto naturale. Entrambi i tipi di gomme poliisoprene sono noti per essere suscettibili all’azione microbica . La maggior parte dei batteri degradanti NR sono stati identificati come membri del gruppo di actinomiceti . C’è solo un rapporto sul trattamento del lattice NR con l’estratto grezzo extracellulare di un batterio Gram-negativo, un Xanthomonas sp.,, conducendo alla formazione di oligomeri con Mw fra 103 e 104 Da . Tuttavia, la capacità di questo ceppo di colonizzare e decomporre la gomma solida era piuttosto scarsa .

In questa comunicazione, viene riportato l’isolamento del ceppo degradante della gomma AL98, che è stato identificato come rappresentante della specie Pseudomonas aeruginosa, indicando che non solo gli actinomiceti sono potenti degradatori di NR e IR., Poiché i membri di questa specie Gram-negativa sono fisiologicamente e geneticamente ben caratterizzati, questo ceppo può offrire vantaggi per la delucidazione delle cause fisiologiche e genetiche della degradazione della gomma.

2 Materiali e metodi

2.1 Gomme

NR latex concentrate (Neotex Latz) è stato ottenuto da Weber e Schaer (Amburgo, Germania) e IR (SKI3) da Continental AG (Hannover, Germania). I guanti in lattice NR (rotiprotect™) sono stati acquistati da Roth (Karlsruhe, Germania).

2.,2 Colture

Le colture liquide sono state effettuate in flaconi di Erlenmeyer da 300 ml contenenti un mezzo di sali minerali (MSM), come descritto in precedenza . NR latex concentrate è stato aggiunto allo 0,8% (v/v) a 30 ml MSM, che corrisponde allo 0,5% di sostanza secca (w/v) considerando le specifiche del fornitore. I guanti in lattice NR sono stati tagliati in piccoli pezzi da 0,15 g e ciascuno è stato aggiunto senza ulteriore trattamento a 30 ml MSM. L’IR è stato tagliato in piccoli pezzi di circa 2-3 mm di diametro, estratto con acetone (1-2 giorni) e 0,15 g sono stati aggiunti a 30 ml MSM., La sterilizzazione a caldo prima dell’inoculazione è stata effettuata in autoclave.

Per la microscopia elettronica a scansione (SEM), le colture IR sono state preparate come segue: 3 g di gomma IR estratta dall’acetone sono stati sciolti in 100 ml di cloroformio per dare una soluzione IR al 3%. Sottili pezzi rettangolari di alluminio con una superficie di circa 1 cm2 sono stati immersi in questa soluzione e asciugati in un flusso d’aria. Questa procedura è stata ripetuta fino a quando entrambi i lati dei pezzi di alluminio sono stati rivestiti completamente con materiale IR., I pezzi rivestiti sono stati sterilizzati con etanolo al 96% e aggiunti a 30 ml di soluzione MSM già autoclavata in flaconi da 300 ml. Le cellule sono state precoltivate durante la notte a 30 ° C in un mezzo complesso Luria-Bertani (LB) da 10 ml, lavate due volte con soluzione salina, risospese in 1 ml di soluzione salina e 10 µl sono state inoculate nelle colture contenenti gomma. I flaconi inoculati sono stati incubati a 30°C e agitati a 180 giri / min.

Le colture solide sono state eseguite in piastre di Petri contenenti agar LB o agar latex MSM., In tal modo sono stati utilizzati due tipi di piastre di agar in lattice: (1) piastre di film di lattice, preparate spargendo il concentrato di lattice come un film sottile direttamente sull’agar MSM, e (2) piastre di sovrapposizione di lattice, preparate versando un sottile strato di agar MSM contenente concentrato di lattice NR disperso ad una concentrazione dello 0,02% (w/v) sopra l’agar MSM L’incubazione delle piastre inoculate è stata effettuata a 30°C.,

Il modello di utilizzo del substrato è stato effettuato utilizzando il sistema di identificazione batterica BBL Oxi / Ferm Tube II (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA) come specificato dai produttori.

2.3 Mineralizzazione

La misurazione della mineralizzazione è stata eseguita in flaconi ermetici di Erlenmeyer da 500 ml determinando il rilascio di CO2 dopo diversi periodi di coltivazione, come descritto di recente . La quantità di substrato di gomma fornita comprendeva in tutti i casi 0,25 g in 50 ml MSM.

2.,4 Colorazione con reagente Schiff

Recentemente è stata mostrata la colorazione dei guanti in lattice NR con reagente Schiff . La procedura analoga applicata qui era la seguente: in una bottiglia ben chiusa, 10 ml del reagente fuchsin sono stati aggiunti a un campione e il colore viola è stato sviluppato per 10-30 min a temperatura ambiente. La quantità in eccesso del reagente è stata quindi scartata e sono stati aggiunti 10 ml della soluzione di solfito per sopprimere la reazione di colore non specifica del campione bianco., La composizione della fucsina reagente è stato il seguente: 2 g fucsina sciolto in 50 ml di acido acetico glaciale plus 10 g Na2S2O5 plus 100 ml di una soluzione 0,1 N HCl plus 50 ml di H2O. La composizione della soluzione di solfito è stato: 5 g Na2S2O5 plus 5 ml di HCl concentrato (37-38%), ad 100 ml con H2O.

2.5 microscopia elettronica a Scansione

NR-guanti in lattice e IR-rivestito di alluminio sottili pezzi sono stati presi dal liquido di culture diverse coltivazione periodi, fissa con il 2,5% di glutaraldeide in 0.1 M tampone fosfato (PBS; pH 7.3) secondo Sørensen ., Dopo il lavaggio con PBS, le colture sono state postfissate in tetrossido di osmio 1% in PBS 0.1 M (pH 7.3) e disidratate in etanolo classificato(30%, 50%, 70%, 90%, 96% e etanolo assoluto). I campioni disidratati sono stati sottoposti al punto critico di essiccazione con CO2 liquida secondo la procedura standard. Successivamente, i campioni sono stati montati su campioni di alluminio utilizzando carbonio conduttore elettricamente (PLANO, Wetzlar, Germania) e sputter-rivestito con circa 15 nm oro utilizzando gas argon come plasma ionizzante. L’imaging è stato eseguito con un microscopio elettronico a scansione S-450 (SEM; Hitachi Ltd.,, Giappone) con elettroni secondari a tensione di accelerazione 20 kV e a temperatura ambiente. Le micrografie sono state registrate da un tubo catodico ad alta risoluzione utilizzando film negativo (Agfapan, APX 100).

2.6 L’analisi di 16S rDNA

L’estrazione del DNA genomico è stata effettuata come descritto in precedenza . L’amplificazione del gene rRNA 16S è stata eseguita utilizzando oligonucleotidi come primer come descritto in . Le sequenze nucleotidiche del prodotto PCR purificato sono state determinate con un sequenziatore di DNA 4000L (LI-COR Inc.,, Biotechnology Division, Londra, NE, USA) e un kit per il ciclo di sequenziamento del primer etichettato con fluorescenza termo sequenasi (Amersham Life Science, Little Chalfont, UK) come specificato dai produttori che impiegano i primer descritti in . Le sequenze rDNA 16S sono state allineate manualmente con sequenze pubblicate da rappresentanti di pseudomonadi ottenuti da EMBL.

3 Risultati

3.,1 Isolamento del ceppo AL98

Sono stati raccolti campioni ambientali da acqua sporca all’interno di pneumatici auto deteriorati in un campo agricolo a Münster, in Germania, e successivamente sottoposti a screening per la presenza di batteri degradanti della gomma. L’isolamento di due nuovi actinomiceti appartenenti al genere Gordonia (ex Gordona) dopo l’arricchimento su materiale granulare del pneumatico è stato precedentemente riportato ., Uno dei campioni è stato arricchito con NR latex concentrate in coltura liquida che ha mostrato un sostanziale aumento della torbidità e una notevole disintegrazione del materiale solido in lattice che è stato inizialmente coagulato completamente in un ciuffo nelle condizioni di coltivazione scelte (agitazione a 180 rpm in MSM). Questa coltura di arricchimento è stata successivamente testata per la crescita su lastre di film di lattice. L’incubazione notturna ha rivelato aree verdastre sul film di lattice., Un ulteriore arricchimento da tali aree su piastre LB ha rivelato singole colonie di un isolato batterico, designato come ceppo AL98, che ha formato colonie verdastre su piastre LB dopo 1 giorno e ha anche portato a una colorazione verdastra scura dell’agar LB dopo 2 giorni. La crescita sulle piastre del film del lattice si è presentata come biofilm senza formazione classica della colonia che causa la colorazione verdastra di entrambi, del materiale del lattice che era nel contatto diretto alle cellule ed anche dell’agar di MSM., Questo colore verdastro è diventato un debole colore rossastro durante l’incubazione prolungata (>1 settimana); questo è stato accompagnato da una compensazione del film di lattice nell’area del biofilm. Non è stato possibile determinare la crescita del ceppo su piastre di sovrapposizione in lattice.

3.2 Classificazione tassonomica

Il ceppo AL98 era un batterio a forma di bastoncello mobile, Gram-negativo, ossidasi-positivo e catalasi-positivo (0,5 µm da 2 a 3 µm). A causa di queste caratteristiche, è stata eseguita l’analisi di identificazione da parte del sistema BBL Oxi/Ferm Tube II., Successivamente, il modello di utilizzo del substrato ha rivelato i seguenti risultati: crescita su arginina, N2, xilosio, glucosio (aerobico), urea e citrato; nessuna crescita su glucosio (anaerobico), lattosio, saccarosio, indolo, maltosio, mannitolo e fenilalanina; reazione indistinta per lisina. Il codice numerico ottenuto ha portato a una classificazione a P. aeruginosa, indipendentemente dal risultato della reazione di lisina.

Ulteriore caratterizzazione tassonomica del ceppo AL98 è stata effettuata mediante analisi del gene 16S rRNA. Il gene quasi completo è stato sequenziato composto da 1530 nucleotidi., Secondo i risultati della ricerca sulla base di dati EMBL, la sequenza ha rivelato le più alte somiglianze che vanno dal 99,9% al 100% a diversi ceppi di P. aeruginosa elencati. Le somiglianze più alte successive erano 98.7% a Pseudomonas resinovorans e 97.7% a Pseudomonas alcaligenes. Secondo Moore et al. I ceppi di P. aeruginosa possiedono una regione di 32 bp nel loro 16S rDNA, corrispondente alle posizioni di E. coli 66-103, che è ipervariabile tra diverse specie del genere Pseudomonas, ma 100% conservato tra i ceppi di P. aeruginosa. Esattamente la stessa sequenza, che è tipica di P., aeruginosa, è stato anche determinato per ceppo AL98 nelle posizioni 58-89. I dati della sequenza genica 16S rRNA sono stati presentati alla base di dati della sequenza nucleotidica EMBL e sono elencati sotto il numero di adesione. AJ249451. Il ceppo AL98 è stato depositato nella collezione di cultura dell’Institut für Mikrobiologie, Münster, Germania, come P. aeruginosa AL98.

3.3 Disintegrazione della gomma naturale

Colture pure di P. aeruginosa AL98 sono state ottenute da piastre LB dopo diversi passaggi su questo mezzo e testate per la crescita su NR latex concentrate., La disintegrazione visibile della gomma coagulata è iniziata solo dopo 2-3 settimane di incubazione. Al contrario, quando le cellule AL98 delle colture di lattice sono state utilizzate come inoculo, la disintegrazione del materiale è già iniziata dopo 2 giorni. Se queste “celle adattate” sono state successivamente sottoposte a diversi passaggi su piastre LB, è stato nuovamente osservato un inizio ritardato del processo di disintegrazione della gomma. È stato generalmente osservato che la crescita è stata ancora più ritardata più passaggi sul mezzo LB sono stati eseguiti. L’osservazione simultanea mediante microscopia ottica ha rivelato in ogni caso solo un tipo di aste mobili., Tuttavia, le cellule lavate da colture adattate tendevano generalmente ad assorbire sulle pareti delle tazze o dei tubi di vetro di Eppendorf utilizzati per il lavaggio in contrasto con le cellule provenienti da colture LB, che erano microscopicamente identiche alle cellule provenienti da colture di lattice, ma non mostravano alcuna proprietà adesiva. I test di crescita eseguiti con diversi altri ceppi di P. aeruginosa provenienti da diverse collezioni di colture, come PAO1, DSM 50071, DSM 939 e ATCC 27853, non hanno rivelato alcuna crescita sulla gomma naturale e hanno mostrato anche una diminuzione del numero di cellule viventi durante l’incubazione su supporti contenenti gomma (dati non mostrati).

3.,4 la Crescita del cis-1,4-poliisoprene

Diversi PI che contengono materiali che sono stati utilizzati come fonti di carbonio suola di determinare la capacità e il grado di crescita di P. aeruginosa AL98 su gomme: NR-lattice concentrato, che contiene >90% del peso a secco di PI, NR guanti di lattice, che corrispondono a vulcanizzata NR, cioè con legami crociati tra le catene polimeriche, nonché di materie sintetiche IR. In tutti i casi la crescita è stata determinata con cellule adattate. Fico. 1A si riferisce al corso temporale della mineralizzazione dei substrati di gomma., Per la valutazione del rilascio di CO2, si è ipotizzato che le gomme impiegate consistessero totalmente in carbonio. Dopo 6 settimane, la migliore mineralizzazione è stata rilevata con NR latex concentrate (36%), seguita da NR latex gloves (26%) e IR (21%). Inoltre, sono stati rilevati anche aumenti della biomassa delle stesse colture per tutti e tre i substrati come mostrato in Fig. 1B che mostra il corso del tempo del conteggio delle cellule viventi durante l’incubazione su questi substrati., Nonostante il comportamento di crescita preferenzialmente adesivo, si è verificato un aumento del numero di cellule sospese nel mezzo durante la coltivazione con NR latex concentrate (35 volte), NR latex glove (11 volte) e IR (sette volte).