Sviluppo del saggio:5 Considerazioni e 8 fondamenti

La capacità di progettare, costruire ed eseguire saggi specifici, sensibili e robusti è fondamentale in tutte le aree della ricerca biomedica. A titolo di esempio, nelle applicazioni di ricerca di base potrebbe essere necessario quantificare i livelli cellulari di una particolare proteina, determinare i livelli di un metabolita nel siero o nelle urine o, forse, confrontare l’attività catalitica di un enzima nel tessuto normale e malato ., Nell’industria farmaceutica e biotecnologica sono necessari saggi per l’identificazione e la caratterizzazione di potenziali nuove molecole di farmaci . Altri studi possono richiedere la misurazione quantitativa dei livelli di espressione genica .

Indipendentemente dall’applicazione specifica o dalla particolare molecola da misurare, una serie di fattori fondamentali devono essere considerati quando si sviluppa un test biologico., È importante prestare particolare attenzione non solo al test stesso, ma anche all’intero flusso di lavoro che deve essere sviluppato dalla preparazione del campione all’analisi della qualità dei dati fornita dal test. Gli aspetti chiave dello sviluppo del saggio discussi in questo articolo sono di applicabilità generale. Sono validi indipendentemente dal tipo di saggio da sviluppare (ad es.,, test basati su anticorpi come ELISA ed elettrochimiluminescenza, determinazione della concentrazione totale di proteine / proteine, saggi di attività enzimatica, saggi basati su cellule o PCR quantitativa, o test specializzati come il test di attivazione a singola molecola ). Allo stesso modo, gli aspetti chiave sono validi indipendentemente dal sistema di rilevamento utilizzato, sia esso basato su assorbanza, fluorescenza, radioattività o persino spettrometria di massa., Ogni saggio specifico avrà le sue idiosincrasie, ma prestando particolare attenzione ai punti discussi di seguito, il ricercatore può aiutare a garantire che sviluppino un saggio robusto, affidabile e adatto allo scopo. Spesso esistono linee guida e/o ampie discussioni sullo sviluppo del test utilizzando tecnologie specifiche, come quelle per la spettrometria di massa mirata alle misurazioni del peptide . Sebbene si concentri sulle questioni particolari dei saggi mirati sugli SM, una serie di punti di discussione sono rilevanti per qualsiasi progetto di sviluppo dei saggi., In particolare, gli autori sottolineano la necessità di adottare un approccio adatto allo scopo per lo sviluppo e la convalida dei saggi . Saggi complessi basati su cellule che mirano a imitare l’ambiente cellulare in vivo stanno giocando un ruolo crescente nella scoperta e nello sviluppo di farmaci. Mentre, i dettagli specifici di tali saggi sono oltre lo scopo di questo articolo, è importante sottolineare che i principi di base dello sviluppo del saggio devono essere rispettati al fine di costruire saggi robusti e affidabili che generano dati significativi .,

I corredi commerciali di sviluppo dell’analisi sono disponibili per facilitare l’istituzione dell’analisi. Ad esempio, Stadtmauer EA et al hanno utilizzato il kit di reagenti ausiliari DuoSet dei sistemi R&D per stabilire un test ELISA che rileva la proteina Cas9 residua nelle cellule T ingegnerizzate da CRISPR . Le organizzazioni commerciali hanno sviluppato una vasta gamma di saggi e dovrebbero prima essere esplorate prima di intraprendere lo sforzo di sviluppare un nuovo saggio. Le analisi del campione includono il MILLIPLEX MAP mouse angiogenesis magnetic bead-based saggio da MilliporeSigma .,

Quando si intraprende un progetto di sviluppo del test, il ricercatore dovrebbe porre una serie di domande per definire i requisiti esatti del test.

Il punto di partenza deve essere assolutamente chiaro su quale molecola e precisamente quale proprietà di quella molecola deve essere misurata. Questo può sembrare ovvio, ma è una questione di fondamentale importanza e sostiene tutte le successive attività di sviluppo del saggio. Ad esempio, il ricercatore desidera misurare la quantità totale di una particolare proteina in un lisato cellulare o solo la forma fosforilata, o sia la proteina totale che quella fosforilata ?, Allo stesso modo, lo studio può dettare che specifiche isoforme o varianti di giunzione della proteina di interesse devono essere misurate . Nel caso di una proteina, è necessario essere chiari sul fatto che il parametro chiave da misurare sia la quantità di proteina presente o la sua funzione biologica, come l’attività enzimatica o l’effetto di una citochina su potenziali bersagli cellulari. In alternativa, può essere accettabile o auspicabile misurare il livello di espressione genica a livello di mRNA., Può darsi che lo studio imponga che vengano sviluppati saggi separati per misurare rispettivamente l’espressione genica, i livelli proteici allo stato stazionario e la funzione biologica ; ogni saggio genererà informazioni diverse ma complementari sulla molecola di interesse.

È importante considerare la fonte della molecola da analizzare. La molecola deve essere misurata in un fluido corporeo, come il siero o l’urina? La molecola deve essere misurata in un organo ottenuto da un animale sperimentale o da un campione bioptico di un paziente?, Forse il materiale di origine sarà tessuto post-mortem. Può essere che la fonte sarà cellule coltivate in vitro, nel qual caso una considerazione importante è se queste saranno cellule primarie scarse o una linea cellulare immortalata facilmente scalabile.

La fonte della molecola determinerà la quantità e la disponibilità del campione. Determinerà anche la concentrazione della molecola di interesse e può influenzare profondamente la sua stabilità, come discusso nelle sezioni seguenti., Pertanto, è probabile che la fonte della molecola di interesse abbia un’influenza significativa sul flusso di lavoro complessivo del test che viene infine sviluppato.

È anche importante comprendere la stabilità della molecola per la quale il test deve essere sviluppato. È relativamente stabile o è estremamente instabile e richiede precauzioni speciali da prendere durante la raccolta e la preparazione del campione per il dosaggio al fine di ottenere dati significativi sul dosaggio?, Anche le molecole stabili in forma isolata possono essere instabili nel complesso ambiente biologico dei campioni da analizzare dove possono essere soggette a ossidazione, proteolisi o perdita di modificazioni post-traduzionali. Può, ad esempio, essere necessario includere agenti riducenti o inibitori della proteasi e/o della fosfatasi nei tamponi del campione per mantenere le molecole nelle loro forme fisiologicamente rilevanti sia durante la preparazione del campione che nel corso del saggio stesso., La fonte della molecola è una considerazione importante qui; una molecola che è stabile, diciamo, siero può rivelarsi estremamente instabile in un omogenato di fegato. Se l’analisi biopsia o tessuto post-mortem è importante sapere come il tessuto è stato manipolato e conservato come questo può influenzare profondamente sia la quantità e la qualità di alcune molecole.,

Al fine di sviluppare un saggio adatto allo scopo è importante decidere fin dall’inizio se una misurazione semi-quantitativa della molecola, come Western blot, soddisfa i requisiti del progetto o se è necessario un dosaggio rigorosamente quantitativo.

È anche importante considerare quanti campioni dovranno essere analizzati. Se solo una manciata di campioni saranno analizzati, un formato di analisi manuale multi-step ad alta intensità di lavoro potrebbe essere perfettamente accettabile., Al contrario, se migliaia o decine di migliaia di saggi devono essere eseguiti, forse come parte di un esercizio di profilatura composto, sarà importante semplificare, snellire e automatizzare il processo di analisi tanto quanto le risorse di laboratorio consentono, con, ad esempio, un formato come microarray. Tuttavia, gli array portano il proprio insieme di problemi, come la variazione spaziale intra-analisi .,

Le risposte a tutte queste domande riguardanti la molecola da analizzare giocheranno un ruolo chiave nell’aiutare il ricercatore a decidere il formato più appropriato per le loro particolari esigenze, e dovrebbero essere tenute in considerazione quando si considerano i fondamenti del test discussi nella prossima sezione.

Dopo aver considerato queste domande riguardanti la molecola da analizzare, si deve prestare particolare attenzione a una serie di questioni tecniche / pratiche fondamentali che si applicano indipendentemente dalla particolare molecola di interesse o dal formato di dosaggio specifico adottato.,

Una considerazione assolutamente fondamentale è la specificità del test. Avendo deciso esattamente quale molecola e parametro di quella molecola deve essere misurata, il ricercatore deve stabilire che il test misurerà solo ciò che vogliono misurare e non nient’altro., Se risulta che il test sta misurando sia la molecola desiderata che altre molecole, allora è possibile che si possano adottare misure per migliorare la specificità del test.

È necessario considerare due aspetti sovrapposti della specificità del dosaggio.

• In primo luogo, i reagenti di rilevamento primari sono opportunamente specifici? Ad esempio, nel caso del test basato su HPLC, quanto è sicuro il ricercatore che un picco identificato in un particolare momento di ritenzione sia la molecola di interesse e non una molecola diversa che capita di co-elutare con la molecola di interesse., Qui dovrebbe essere considerata la fonte dell’analita. L’analisi dei campioni di urina non può dar luogo a picchi di co-elusione con la molecola di interesse. Tuttavia, lo stesso potrebbe non essere vero per i campioni di omogenati di siero o di tessuto analizzati nello stesso test. In un test basato su anticorpi, l’anticorpo impiegato è assolutamente specifico per la proteina bersaglio o reagisce anche in modo incrociato con altre proteine?, È possibile ottenere anticorpi specifici per una particolare proteina o una particolare modifica post-traslazionale, come la fosforilazione in un sito specifico o un neo-epitopo generato dopo la scissione da una proteinasi . Abbastanza spesso, si desidera un anticorpo con maggiore affinità . Tali reagenti anticorpali devono essere caratterizzati rigorosamente nelle condizioni effettive del saggio per garantire che abbiano la specificità desiderata, reagendo solo con il prodotto desiderato e non con il substrato/molecola precursore., Nei test che non utilizzano il rilevamento di anticorpi, come un test di scissione del peptide fluorogenico, il grado di specificità sarà molto più basso. Invece di scissione in un sito specifico che genera un segnale, scissione in qualsiasi sito all’interno del peptide sarà ora dare origine a un segnale.
• Questo ci porta al secondo aspetto della specificità del saggio ed è un problema particolare per i saggi enzimatici in vitro., Anche se i reagenti di rilevamento sono specifici per un particolare evento che si desidera analizzare, potrebbe essere che in un lisato di cellule grezze o in un omogenato tissutale più enzimi siano in grado di effettuare lo stesso evento (ad esempio, fosforilazione, scissione proteolitica o altra modifica post-traslazionale). Questo problema sarà ancora maggiore per l’esempio di analisi di scissione del peptide fluorogenico sopra riportato., Il problema di molteplici attività sovrapposte nei lisati grezzi può spesso essere superato con l’inclusione di una fase aggiuntiva di preparazione del campione, come una specifica immuno-precipitazione, al fine di ottenere la specificità del dosaggio desiderata . In alternativa, a seconda della natura dello studio, la soluzione migliore può essere quella di eseguire il test di attività utilizzando enzima altamente purificato (nativo o ricombinante).

Quanto deve essere sensibile il test? Ciò sarà determinato sia dai livelli della molecola di interesse nel campione che dal volume di campione disponibile., Il punto importante è che il saggio deve essere sufficientemente sensibile in modo tale che il livello della molecola ricada bene all’interno della gamma dinamica del saggio (vedi sotto). Questa è una considerazione importante quando si decide il formato di dosaggio e il sistema di rilevamento. Se è richiesta una grande sensibilità, è più probabile che una fluorescenza, piuttosto che un’assorbanza, dia la sensibilità desiderata. La sensibilità può anche essere aumentata utilizzando l’amplificazione enzimatica del segnale originale ., Tali sistemi di dosaggio “accoppiati” possono essere estremamente sensibili, ma offrono anche maggiori opportunità per il campione di analisi di interferire con il saggio (vedi sotto).

È importante determinare la gamma dinamica del test. In altre parole, l’intervallo in cui la lettura del saggio è proporzionale alla quantità di molecola bersaglio nel campione analizzato., Nel caso di un saggio per misurare la concentrazione di una molecola, è importante che il saggio (indipendentemente dal formato adottato) sia opportunamente calibrato mediante la costruzione di un’adeguata curva di calibrazione come l’esempio ipotetico in Figura 1. Allo stesso modo, nel caso di un saggio enzimatico, si deve garantire che il saggio funzioni in un intervallo tale da misurare la velocità iniziale della reazione e che la velocità misurata sia proporzionale alla quantità di enzima aggiunto al saggio., Per rimanere all’interno della gamma dinamica del saggio (alcuni) campioni possono avere bisogno di essere diluiti o concentrati. Questo può essere un problema particolare se la molecola di interesse è presente a livelli molto diversi in diversi campioni. La mancata permanenza all’interno della gamma dinamica del test comporterà la generazione di dati spuri. Le gamme dinamiche devono anche essere testate in vivo, se il saggio deve essere utilizzato in vivo, ad esempio utilizzando linee cellulari che esprimono un obiettivo anticorpale a diversi livelli per lo sviluppo di un saggio IHC .,

Figura 1. Calibrazione del dosaggio / gamma dinamica.

Quando si progetta un test, è importante considerare i fattori che possono interferire con la lettura del test portando a risultati errati. La questione della specificità del dosaggio è discussa sopra. Qui discutiamo di altri fattori che possono interferire con la lettura del test.

Nel caso di una lettura fluorescente è importante assicurarsi che il campione da analizzare non estingua la lettura fluorescente., Questo può essere un problema particolare con i saggi che utilizzano lisati cellulari grezzi o omogenati tissutali. Allo stesso modo, nei test enzimatici o cellulari fluorogenici utilizzati per scopi di screening/profilazione dei composti, il ricercatore deve garantire, per quanto possibile, che i composti di prova non estinguano la lettura fluorescente. Tali composti mostrerebbero l’attività inibitoria potente apparente mentre realmente non hanno effetto inibitorio diretto sul loro obiettivo destinato. Alcuni composti possono essi stessi fluorescenza, dando così un segnale falso saggio., Tale interferenza composta può essere ridotta utilizzando reporter fluorescenti che eccitano ed emettono a lunghezze d’onda più lunghe . Un altro problema comune è l’interferenza da parte dei componenti del campione, come agenti riducenti o detergenti con alcuni dei saggi proteici popolari.

Nei saggi accoppiati enzimaticamente (siano essi saggi di attività enzimatica o di metaboliti) è essenziale determinare che gli enzimi accoppiati non misurino inavvertitamente qualche componente del campione diverso dalla molecola di interesse., Se tali saggi sono utilizzati per lo screening o la caratterizzazione dei composti, è importante assicurarsi che il saggio sia configurato in modo tale da misurare l’inibizione dell’enzima bersaglio e non degli enzimi di accoppiamento . Se si sospetta un’interferenza significativa da parte dei componenti del campione di analisi, è necessario considerare attentamente le fasi come le precipitazioni (immuno) o la purificazione parziale al fine di rimuovere tali componenti . Il punto chiave è, indipendentemente dal formato di dosaggio adottato, essere attenti alle potenziali fonti di interferenza e ai modi per eliminare o ridurre al minimo il loro impatto sul dosaggio., Non si deve presumere che un saggio sviluppato per misurare una molecola in un particolare tipo di tessuto/cellula/fluido biologico si comporti in modo accettabile quando il saggio viene eseguito su campioni provenienti da una fonte diversa; il saggio dovrà essere convalidato nuovamente per la nuova fonte del campione.

Per fornire dati affidabili e utilizzabili, il saggio deve essere robusto e riproducibile. Il saggio deve essere robusto in quanto non è indebitamente influenzato da cambiamenti nella preparazione e nella manipolazione del campione., Allo stesso modo, dovrebbe dare gli stessi risultati indipendentemente dall’individuo che opera il test. Il saggio deve essere altamente riproducibile (detto anche precisione) in modo che il grado di variazione sia il più piccolo possibile sia su base intra che inter saggio. In una singola esecuzione del test, le repliche di un campione standard e di un campione “reale” dovrebbero fornire valori molto simili, rispettivamente. Allo stesso modo, ci dovrebbe essere poca variazione giorno per giorno nei valori di dosaggio ottenuti.,

Se il test è quello di misurare la quantità assoluta (piuttosto che relativa) di una molecola, allora deve essere calibrato (vedi sopra) contro uno standard accettato al fine di fornire una quantificazione accurata. A volte il flusso di lavoro del test richiede un significativo workup del campione (ad esempio, concentrazione, rimozione di componenti del campione interferenti, ecc..) in modo che la molecola di interesse possa essere misurata in modo affidabile. In questi casi è altamente auspicabile includere uno standard interno per correggere le perdite di analiti attraverso il flusso di lavoro di analisi., Ad esempio, nel caso di saggi MS, l’estratto da analizzare può essere “a spillo” con una quantità nota di isotopo stabile della molecola di interesse. Per un test HPLC lo standard interno potrebbe essere un composto strutturalmente correlato alla molecola di interesse e che non è altrimenti presente nel campione di analisi. L’uso di uno standard interno è particolarmente importante se sono richiesti dati quantitativi molto precisi e accurati .,

I livelli di robustezza, riproducibilità e accuratezza accettabili dipendono dallo scopo del test e devono essere decisi dal ricercatore per il proprio particolare uso corrente.

Supponendo una distribuzione gaussiana, due risultati, la cui media differisce per > 2 deviazioni standard (SD) sono considerati statisticamente significativamente diversi al livello di confidenza del 95%., Due risultati che differiscono in modo simile per >3 SD sono considerati statisticamente significativamente diversi al livello di confidenza del 99,7%. Pertanto, maggiore è la riproducibilità (precisione) del test, e quindi minore è la SD delle letture sperimentali, più discriminante sarà il test.

Figura 2. Misurazione delle prestazioni del saggio.

Le prestazioni del test possono essere analizzate in diversi modi., Il rapporto segnale-sfondo o finestra del segnale (S/B = segnale medio / sfondo medio) e il rapporto segnale-rumore (S/N = segnale medio-sfondo medio / SD di sfondo) sono spesso usati come misure delle prestazioni del test. Tuttavia, questi rapporti non tengono adeguatamente in considerazione la variabilità del dosaggio. È stato sviluppato un semplice test statistico, il valore Z’, che fornisce una misura della qualità del saggio che tiene conto sia della finestra del segnale che della variabilità del saggio . Più alto è il valore Z ‘(Figura 2), più discriminante è il saggio, con un saggio perfetto avente una Z’ di 1., Per un test di screening ad alto throughput un valore Z ‘di > 0.5 è generalmente considerato accettabile. Sebbene la statistica Z ‘ sia stata originariamente derivata per valutare i saggi HTS, è una misura generale della qualità del saggio e può essere applicata a qualsiasi saggio .

I test ad alta produttività utilizzati nella scoperta di farmaci utilizzano frequentemente reporter fluorescenti e luminescenti per consentire di eseguire un gran numero di test in modo automatizzato., Tuttavia, con lo sviluppo di nuove tecnologie, vi è un crescente interesse per l’uso di saggi cellulari privi di etichetta che utilizzano metodi di rilevamento biofisico . Un certo numero di strumenti per saggi privi di etichetta sono ora disponibili in commercio . È importante sottolineare che i test privi di etichetta evitano il potenziale di artefatti causati dalla presenza del sistema reporter. Ad esempio , la molecola reporter bioluminescente comunemente usata lucciola luciferina è essa stessa un agonista parziale di GPR35, complicando così potenzialmente l’interpretazione dei dati composti/farmacologici., Un ulteriore vantaggio dei saggi privi di etichetta è che consentono lo screening dei composti contro i livelli endogeni dei recettori nelle cellule primarie e staminali rilevanti per la malattia .

Interazioni reporter-composti inaspettate possono verificarsi anche in saggi biochimici (oltre ai problemi di spegnimento e autofluorescenza discussi sopra). Ad esempio, un certo numero di composti che hanno dimostrato di attivare l’attività della proteina deacetilasi di SIRT1 utilizzando un substrato peptidico marcato con TAMRA non aveva attività nei saggi enzimatici utilizzando una versione non etichettata dello stesso peptide o un substrato proteico nativo a lunghezza intera., L’attivazione osservata con il substrato marcato con TAMRA è stata un artefatto dovuto a un’interazione fisica diretta dei composti con il fluoroforo TAMRA .

Pertanto, quando si progettano e convalidano saggi per scopi di screening / profilatura di composti, è importante considerare il potenziale di interazioni composto-reporter. I potenziali benefici derivanti dall’utilizzo di un dosaggio privo di etichette ad un certo punto della cascata di screening dovrebbero essere presi in seria considerazione.