Exonization si verificano eventi in introni arricchito con nuovi trasposoni
Per indagare il potenziale per nuovi exonization il verificarsi degli eventi all’interno del transcriptome umano, abbiamo analizzato oltre 400 shRNA atterramento di RNA-seq set di dati da cellulare HepG2 linee per identificare legge mapping tra noto esoni e romanzo intronic sequenze (Fig. 1a e la sezione “Metodi”)., Abbiamo considerato solo la mappatura delle letture alle giunzioni esone-esone (EEJ) supportate da almeno 5 letture e un valore percentuale giuntato in (PSI) di almeno 5%. I nuovi esoni sono stati definiti come quelli assenti dai database di annotazione e da tutti i set di dati di controllo non perturbati (Fig. 1 bis). Confermando la validità di questo approccio, l’abbattimento della ribonucleoproteina C eterogenea RNA binding protein (RBP) (hnRNPC) ha creato gli eventi di esonizzazione più derivati dall’Alu (File aggiuntivo 1: Figura S1), in linea con le osservazioni precedenti . In totale, abbiamo rilevato 13.103 nuovi eventi esonici all’interno di 4774 geni o 30.,6% dei geni codificanti proteine umane valutati sotto le perturbazioni che abbiamo esaminato.
Caratteristiche genomiche degli introni con eventi di esonizzazione. un flusso di lavoro per identificare nuovi eventi di esonerazione (vedere la sezione “Metodi”). In breve, RNA-seq da Shrna knockdown di RNA binding proteins in HepG2 viene analizzato da 2-pass abilitato STELLA, e poi nuove giunzioni sono incorporati in file di indice analizzati da Whippet ., Gli esoni identificati vengono filtrati per rimuovere le giunzioni esone-esone e gli eventi che si verificano in uno qualsiasi dei campioni di controllo abbinati, nonché annotati nei database del genoma. Sono inclusi solo gli eventi supportati da > 5 letture di mapping su giunzioni esone-esone e una percentuale di giunture in (PSI) superiore al 5%. b Diagramma che mostra i risultati di un’analisi di regressione lineare logistica volta a identificare caratteristiche importanti nella discriminazione degli introni inclini a eventi di esonerazione a tutti gli altri introni espressi., Le caratteristiche in grassetto contribuiscono in modo significativo al modello (p < 0.01, Student t test). TSS, sito di inizio trascrizione; ppt_len, lunghezza del tratto polipirimidinico; 5’ss, 5′-sito di giunzione; 3’ss, 3′-sito di giunzione; bp_scr, punteggio branchpoint; SS_dist, distanza del sito di giunzione; BP_num, numero di branchpoint; AGEZ, lunghezza della zona di esclusione dinucleotide AG; TAD, dominio topologicamente associato; ppt_scr, punteggio del tratto polipirimidinico (n = 13,103)., c Diagramma che mostra i risultati di un’analisi di regressione lineare logistica volta a identificare il tipo di elementi trasponibili che discriminano più efficacemente gli introni soggetti ad eventi di esonerazione rispetto a tutti gli altri introni espressi. Le caratteristiche in grassetto contribuiscono in modo significativo al modello (p < 0.01, Student t test). I nodi sono colorati in base all’età media stimata di quando sono sorti elementi trasponibili (n = 13.103)., d Mappa di arricchimento per le categorie funzionali GO, REACTOME e KEGG di geni che contengono eventi di Alu-exonization, con termini GO rappresentativi mostrati per ogni sottorete (vedere il file aggiuntivo 1: Figura S1 per la versione annotata)., Nodo dimensione è proporzionale al numero di geni associati con il PASSARE di categoria, e la larghezza del bordo è proporzionale al numero di geni condivisi tra categorie GO
Per indagare i meccanismi alla base di questi exonization eventi, abbiamo raccolti un elenco di caratteristiche classicamente associate con splicing alternativo, compreso il sito di splice forza, il contenuto di GC, e polypyrimidine del tratto di lunghezza (file Aggiuntivo 2: Tabella S1)., La regressione lineare logistica è stata quindi utilizzata per confrontare questi eventi con un gruppo “di fondo” di introni espressi privo di prove di esonizzazione (Fig. 1 ter). Convalidando la nostra scelta di caratteristiche genomiche, il nostro modello raggiunge un alto tasso medio di vero positivo del 75,2% (File aggiuntivo 1: Figura S1). Inoltre, siamo stati in grado di confermare i risultati precedenti che gli eventi di esonizzazione tendono a verificarsi in introni lunghi con un alto contenuto di GC (File aggiuntivo 1: Figura S1, lunghezza introne: p < 3.53 × 10-59, GC 1.01 × 10-73, test Student t)., In particolare, troviamo exonization eventi spesso si sovrappongono al nucleosoma siti di legame (file Aggiuntive 1: Figura S1, p < 2.37 × 10-23, il test di Wilcoxon test), raramente si verificano a 3-fine del gene del corpo (p < 5.90 × 10-21, test t di Student) e mostra una significativa tendenza a verificarsi entro 5 UTRs (file Aggiuntive 1: Figura S1, p < 7.13 × 10-166, test esatto di Fisher). È importante sottolineare che osserviamo anche che il più forte predittore per l’esonerazione era il verificarsi di elementi trasponibili che si sovrapponevano al nuovo esone (Fig., 1b e file aggiuntivo 1: Figura S1, p < 6.46 × 10-127, Studente t test). Rispetto a questi forti predittori, nessun elemento di splicing cis-regulatory contribuisce in modo significativo al modello o mostra differenze significative tra i set di dati (File aggiuntivo 1: Figura S1, p > 0.05, Student t test).
Per valutare la conservazione del nuovo utilizzo degli esoni tra le specie, abbiamo analizzato l’entità dell’esonizzazione tra più tipi di tessuto abbinati all’interno di quattro specie di primati che coprono 30 milioni di anni di evoluzione dei primati., Per esplorare l’uso di esonizzazione tra campioni, i geni con eventi che si verificano in tutte e quattro le specie sono stati identificati e ordinati utilizzando il clustering di propagazione per affinità. In linea con lo splicing alternativo canonico, campioni della stessa specie invariabilmente raggruppati insieme (file aggiuntivo 1: Figura S2). L’eccezione notevole a questa tendenza è stata osservata nei campioni dai testicoli, che hanno mostrato il clustering tessuto-specifico. Ciò suggerisce che all’interno dei testicoli c’è una forte firma di esonizzazione conservata tra le specie di primati in più geni (File aggiuntivo 1: Figura S2).,
Per indagare ulteriormente l’influenza dei retrotrasposoni sull’esonizzazione, abbiamo suddiviso gli elementi trasponibili nelle loro principali sottofamiglie. In linea con la specificità del lignaggio degli eventi di esonizzazione, i contributori più significativi al modello sono i trasposoni di età inferiore a 70 milioni di anni. In particolare, i membri della sottofamiglia degli elementi AluJ e ALU, così come gli elementi L1 altamente mobili, sono forti predittori (Fig. 1c). È interessante notare che un’eccezione a questa regola è la sottofamiglia AluY, che mostra uno schema che ricorda eventi di trasposone molto più vecchi (Fig. 1c)., Questa differenza è potenzialmente dovuta alla sua deplezione relativa all’interno dei corpi genici (3%, 19%, AluY, AluS, occorrenza in introni espressi). Infine, abbiamo voluto valutare quale tipo di geni contiene eventi di Alu-exonization. È interessante notare che troviamo un forte arricchimento per le funzioni relative alla segnalazione cellulare e alla regolazione del ciclo cellulare (Fig. 1d, File aggiuntivo 1: Figura S1 e file aggiuntivo 3: Tabella S2). Accanto agli esempi precedenti, la nostra osservazione di un ampio numero di eventi di esonizzazione che si sovrappongono a nuovi trasposoni suggerisce una nuova fonte di complessità trascrittomica.,
le proteine leganti l’RNA m6a sopprimono l’esonizzazione
Una valutazione dei trans-fattori che promuovono l’esonizzazione (file aggiuntivo 1: Figura S2 e file aggiuntivo 4: Tabella S3) ha rivelato un arricchimento dei RBP leganti m6a (N6-metiladenosina), specialmente tra i nuovi esoni contenenti Alu (Fig. 2a, p< 0.05, test ipermetrico). Ciò ha incluso hnRNPC, che è stato precedentemente indicato per indurre un gran numero di eventi di esonizzazione Alu-specifici , così come la regione critica di sindrome di DiGeorge 8 (DGCR8) e la proteina contenente il dominio YTH 2 (YTHDC2)., Per esaminare il potenziale ruolo dei marchi m6a nell’esonerazione, abbiamo analizzato i dati di knockdown della subunità dell’enzima di modifica m6a N6-adenosina-metiltransferasi (METTL3) . Questa analisi ha rivelato un aumento significativo del numero di eventi di esonerazione rilevabili al knockdown di METTL3 (Fig. 2b, p < 3.57 × 10-03, Wilcox-rank sum test), in concordanza m6a che regola l’inclusione di nuovi esoni. Ulteriori analisi di questi eventi di esonerazione METTL3-dipendenti hanno rivelato un arricchimento funzionale dei geni associati al danno al DNA (p < 2.,68 × 10-02, valore p corretto da FDR). Successivamente, abbiamo analizzato i dati delle cellule HeLa che costituiscono due knockdown di regolatori m6a noti (fattore di splicing ricco di serina/arginina 3 (SRSF3) e proteina contenente il dominio YTH 1 (YTHDC1)) e due knockdown di RBPS non noti per riconoscere direttamente m6a (fattore di splicing ricco di serina/arginina 9 e 10 (SRSF9 e SRSF10)). In accordo con i risultati precedenti, troviamo che il knockdown di SRSF3 o YTHDC2 induce fortemente l’esonerazione mentre la diminuzione dell’espressione di SRSF9 o SRSF10 ha poco o nessun impatto (File aggiuntivo 1: Figura S2).,
la metilazione m6a sopprime l’esonerazione. a Barplots di geni associati alla m6a-metilazione e il numero di nuovi esoni identificati al knockdown nelle cellule HepG2 b Barplot che mostra il numero di eventi di esonizzazione indotti al knockdown di N6-adenosina-metiltransferasi (METTL3) rispetto a un campione di controllo. valore p calcolato utilizzando Wilcoxon-rank sum test. c Boxplots che mostrano picchi intronici m6a normalizzati per nucleotide da RNA nascente in cellule HepG2., Gli elementi Alu a livello genomico si verificano all’interno di introni espressi senza eventi di esonerazione identificati. I riquadri mostrano l’intervallo interquartile come una scatola solida, 1,5 volte l’intervallo interquartile come linee sottili verticali, la mediana come linea orizzontale e l’intervallo di confidenza attorno alla mediana come tacca. nt, nucleotide (n = 13.247). d diagramma che mostra la copertura m6a relativa nei nucleotidi che circondano gli elementi Alu. Vedere c per la descrizione di “genome-wide”., (n = 13.247)
Per valutare ulteriormente se la modifica di m6a influisce sugli eventi di esonizzazione, abbiamo valutato l’arricchimento dei siti di m6a all’interno delle sequenze esonerate . Questo approccio ha usato BrU-seq seguito dall’isolamento dei frammenti m6a-metilati facendo uso di un anticorpo m6a-specifico . A causa della natura ripetitiva degli elementi Alu, abbiamo utilizzato la massimizzazione delle aspettative per assegnare letture multimapping (massimo di 10 corrispondenze consentite) agli elementi Alu in base all’espressione del gene ospite ., Come set di confronto, abbiamo esaminato tutti gli elementi Alu all’interno di regioni introniche espresse che non si trovano nelle vicinanze di un nuovo esone (vedere la sezione “Metodi”). Questa analisi ha rivelato un forte arricchimento della mappatura dei siti m6a in elementi Alu esonerati (Fig. 2c, p< 3.23 × 10-123, Wilcoxon rank-sum test; Fig. 2d, p < 2.13 × 10-63, Wilcoxon rank sum test; File aggiuntivo 1: Figura S2). Complessivamente, ciò suggerisce che la modifica di m6a e le proteine leganti sono regolatori chiave degli eventi di esonizzazione (contenenti Alu).,
Meccanismi che aumentano la “finestra di opportunità” per il reclutamento di spliceosome promuovono l’esonerazione
La nostra analisi iniziale ha rivelato che la previsione dell’esonerazione è fortemente migliorata dagli elementi di ripetizione, dalla lunghezza dell’introne e dal contenuto di GC. Queste caratteristiche sono note per correlare negativamente con il tasso di allungamento della RNA polimerasi II (RNAPII). Abbiamo quindi ipotizzato che i cambiamenti nel tasso di allungamento RNAPII possano promuovere l’esonerazione., Per testare questo, abbiamo analizzato i dati RNA-seq da cellule umane che esprimono mutazioni che aumentano (E1126G) o diminuiscono (R749H) il tasso di allungamento della RNA polimerasi II (RNAPII) . Per determinare il tasso di allungamento per ogni mutante, abbiamo analizzato i dati del test di sequenziamento nucleare run-on genome-wide (GRO-seq) combinato con l’inibitore di allungamento della trascrizione DRB (vedere la sezione “Metodi” e ). Osserviamo che le mutazioni che rallentano il tasso di allungamento RNAPII (R749H) hanno fortemente indotto eventi di esonizzazione (Fig. 3a, TUTTI: p < 3.,18 × 10−45, Fisher’s exact test), with this change especially strong in Alu-containing novel exons (Fig. 3a, ALU: p < 5.62 × 10−53, Fisher’s exact test). In contrast, mutations that speed up elongation had negligible effects on the number of exonization events detected (Fig. 3a; p > 0.05, Fisher’s exact test).
Reduced rate of RNA polymerase II elongation and poor splicing efficiency promotes exonization., un diagramma a punti che mostra l’impatto delle mutazioni della RNA polimerasi sull’esonizzazione di esoni contenenti Alu. WT, wildtype; Veloce, mutazione E1126G; Lento, mutazione R749H. Ogni punto rappresenta il set di dati individuale. KB, kilobase; min, minuti. Allungamento, tasso di allungamento trascrizionale (vedere la sezione “Metodi” e ). b Boxplot di efficienza di splicing per introni con eventi di esonizzazione rispetto a tutti gli introni espressi senza evidenza di esonizzazione. L’efficienza di splicing è una metrica che descrive la velocità di escissione dell’introne misurata valutando l’RNA-seq nascente usando BRU-chase a 0, 15, 30 e 60 min. Vedi Fig., 2d per la descrizione di boxplots. *** p< 1 × 10-10 p valore calcolato utilizzando Wilcoxon-rank sum test. (n = 4.011). c Stacked bar plot che mostra le distribuzioni di introni per l’efficienza di splicing identificato da BrU-chase. Gruppi assegnati da K-means clustering (k = 5) (vedere la sezione “Metodi”)—vedere il file aggiuntivo 1: Figura S3a per le distribuzioni delle efficienze di splicing., (n = 83,972)
Questo risultato supporta il modello di competizione di splicing alternativo in cui la regolazione dell’inclusione di esoni è associata a una “finestra di opportunità” per il riconoscimento di spliceosome. Se questa connessione tra esonizzazione e opportunità è valida, un meccanismo indipendente per l’emergere di nuovi esoni dovrebbe verificarsi all’interno di introni che vengono lentamente elaborati dal macchinario di splicing., Per valutare questa ipotesi, abbiamo analizzato i dati di RNA nascenti da BrU-Chase-seq, in cui le cellule sono etichettate con un impulso BrU 15-min e inseguite per 0, 15, 30 e 60 min. Per determinare la cinetica di splicing per ogni introne, abbiamo calcolato la dinamica dell’efficienza di splicing (SEDs) o la velocità di escissione dell’introne (vedere la sezione “Metodi”). K-means clustering è stato quindi utilizzato per identificare cinque gruppi di introni con SEDs che vanno da molto veloci a molto lenti (File aggiuntivo 1: Figura S3). Gli introni contenenti eventi di esonerazione sono stati quindi confrontati con un insieme di sfondo di tutti gli introni espressi., Sorprendentemente, questa analisi rivela che gli introni contenenti eventi di esonizzazione sono fortemente arricchiti all’interno del cluster SED più lento (Fig. 3b, p < 3.23 × 10-239, Wilcox rank-sum test, e file aggiuntivo 1: Figura S3). Inoltre, questi introni mostrano una riduzione altamente significativa del SED rispetto ai gruppi di sfondo (Fig. 3c e file aggiuntivo 1: Figura S3, p< 2.2 × 10-160, Wilcoxon rank-sum test)., Insieme, queste osservazioni suggeriscono che i meccanismi che espandono la “finestra di opportunità” aumenteranno la probabilità di riconoscimento da parte del macchinario di splicing e quindi promuoveranno il tasso di esonerazione.
Il danno al DNA induce l’esonizzazione all’interno dei geni del ciclo cellulare
Il processo esogeno può anche promuovere alterazioni nell’allungamento della trascrizione e quindi può alterare i tassi di esonizzazione., Per indagare su questo ci siamo concentrati sull’irradiazione UV poiché studi precedenti hanno dimostrato che promuove sia l’iperfosforilazione di RNAPII che porta alla successiva inibizione dell’allungamento della trascrizione e al reclutamento del macchinario m6a nei siti di danno al DNA . Utilizzando i dati ottenuti dal nascente RNA-seq (protocollo GRO-seq), abbiamo valutato l’impatto dell’irradiazione UV sull’Alu-exonizzazione in un periodo di 24 ore . Sorprendentemente, a seguito della forte diminuzione del tasso di allungamento RNAPII su irradiazione UV troviamo un altrettanto sorprendente forte aumento del tasso di esonizzazione (Fig., 4a e file aggiuntivo 1: Figura S4). Questa incorporazione di nuovi esoni continua a salire finché il tasso di allungamento RNAPII rimane basso. È importante sottolineare che il pieno recupero del tasso di allungamento RNAPII al segno 24-h è accompagnato da una precipitosa caduta del numero di eventi di esonizzazione rilevabili (Fig. 4a e file aggiuntivo 1: Figura S4).
L’irradiazione UV aumenta il numero di esonizzazione all’interno dei geni del ciclo cellulare che promuovono la ritenzione della trascrizione nel nucleo., un diagramma di linea che mostra i risultati dell’analisi GRO-seq dopo irradiazione UV (ultravioletta). La linea tratteggiata rappresenta la stima basata sui dati della carta originale . Vedere i dati originali nel file aggiuntivo 1: Figura S4. La regione ombreggiata gialla rappresenta l’applicazione UV (n = 3.278). b Trama di distribuzione cumulativa del cambiamento nell’espressione dei geni all’interno della frazione del polisoma rispetto alla frazione di cellule intere. Una trama di distribuzione cumulativa descrive la proporzione di dati (asse y) minore o uguale a un valore specificato (asse x). Distribuzione cumulativa F( x), funzione di distribuzione cumulativa., valore p calcolato utilizzando Wilcoxon-rank sum test. c Boxplots che mostrano cambiamenti normalizzati (cambiamento in TPM/max (TPM)) nella differenza di espressione tra RNA-seq totale e RNA-seq impegnato ribosomiale dopo irradiazione UV. I geni sono binned per cento impiombato in (PSI) aumento del nuovo esone esonerato dopo irradiazione UV. Dimensione del campione del contenitore da sinistra a destra: n = 427, 158, 355, 410 e 438. Vedi Fig. 2d per la descrizione di boxplots. Valori P calcolati utilizzando Wilcoxon-rank sum test. TPM, trascrizioni per milione., d Categorie funzionali di geni che subiscono l’esonerazione dopo irradiazione UV rispetto al set di dati di controllo (vedere anche il file aggiuntivo 1: Figura S4). FDR, false discovery rate
Date le precedenti scoperte che le sequenze contenenti Alu possono promuovere la ritenzione nucleare , abbiamo studiato se all’irradiazione UV l’impegno polisomico dei geni fosse influenzato dall’esonizzazione ., In particolare, dopo l’irradiazione UV identifichiamo una significativa diminuzione dei livelli di espressione di geni contenenti eventi di esonizzazione contenenti Alu all’interno della frazione del polisoma, rispetto all’espressione di RNA-seq a cellule intere (Fig. 4b, p< 8.50 × 10-22, Wilcoxon rank-sum test). Inoltre, la forza mediana di questo esaurimento aumenta con la percentuale di inclusione dei nuovi esoni (Fig. 4c ,p < 1.49 × 10-06, Wilcox rank-sum test).,
Siamo stati successivamente interessati a studiare il tipo di geni in cui gli eventi di esonizzazione sono promossi dopo l’irradiazione UV. È interessante notare che c’è un forte arricchimento per i geni coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare e nel legame dell’RNA (Fig. 4d e file aggiuntivo 1: Figura S4). Complessivamente, questi risultati suggeriscono che il danno al DNA downregulates l’impegno ribosomiale dei geni del ciclo cellulare parzialmente attraverso la promozione di eventi di esonizzazione contenenti elementi Alu, che sono noti per indurre ritenzione nucleare ., Infine, abbiamo studiato se questo fosse un meccanismo evolutivamente conservato valutando i tassi di esonizzazione dopo irradiazione UV nei fibroblasti embrionali di topo. Sorprendentemente, identifichiamo un chiaro aumento degli eventi di esonizzazione nei campioni trattati con UV rispetto a quelli non trattati con l’inclusione di ripetizioni B specifiche per roditori particolarmente colpite (File aggiuntivo 1: Figura S4). L’analisi funzionale dei geni contenenti nuovi esoni ha rivelato ancora una volta un forte arricchimento per i geni del ciclo cellulare (File aggiuntivo 1: Figura S4).,
L’esonerazione è esaurita nei tumori ematologici
Lo splicing aberrante è un segno distintivo del cancro e contribuisce a numerosi aspetti della biologia tumorale . I cambiamenti Cancro-associati in splicing sono stati collegati all’espressione alterata di RBPs, alcuni di cui sono oncogenic o fungono da soppressori del tumore . Nonostante l’ampia evidenza di splicing alterato nel cancro, la misura in cui questi cambiamenti influenzano l’esonerazione non è stata esplorata., Abbiamo quindi valutato il verificarsi di esonerazione attraverso tumore abbinato e campioni di controllo di pazienti all’interno di una varietà di tumori diversi (File aggiuntivo 5: Tabella S4). Sorprendentemente, questa analisi ha rivelato una soppressione significativa e riproducibile dell’esonizzazione all’interno di campioni di pazienti con leucemia linfocitica cronica (CLL) e sindromi mielodisplastiche (MDS) (Fig. 5a, CLL: p <2,14 × 10-04; MDS: p<1,15 × 10-04; AML: p< 4.,02 × 10-09; Wilcoxon rank-sum test), che era indipendente dalle modifiche alle espressioni (File aggiuntivo 1: Figura S5). Inoltre, questa soppressione dell’esonerazione è specifica per le neoplasie ematologiche (Fig. 5b, p< 2.93 × 10-09, Wilcoxon rank sum test). Coerentemente con le nostre osservazioni precedenti, l’inclusione di nuovi esoni viene soppressa all’interno dei geni associati al ciclo cellulare e all’elaborazione dell’mRNA (File aggiuntivo 1: Figura S5 e file aggiuntivo 6: Tabella S5, p < 1 × 10-5, corretto FDR, rispetto ai campioni di controllo).,
Hematologic cancers display decreased exonization. a Boxplots displaying percentage change in Alu-exonized events compared to matched patient controls. Dots represent data from individual samples. See Fig. 2c for the description of boxplots. SCLC, small cell lung cancer; MDS, myelodysplastic syndromes; CLL, chronic lymphocytic leukemia; AML, acute myeloid leukemia. b Boxplots showing data from a collated into two major cancer types. See Fig., 2c per la descrizione di boxplots. c Boxplots che mostrano cambiamenti nell’esonizzazione dell’Alu rispetto a campioni di controllo abbinati in linee cellulari che esprimono proteine leganti l’RNA con mutazioni tumorali note. Vedi Fig. 2c per la descrizione di boxplots. d Dot plot che mostra i cambiamenti nell’esonerazione Alu di campioni MDS raggruppati per geni contenenti mutazioni. Ogni punto rappresenta i dati di uno studio individuale. e Dot plot che mostra il numero di eventi esonerati nei campioni di linea cellulare SET2 e nei campioni di pazienti prima e dopo la somministrazione dell’inibitore di bromodomain ARV-825., Sono inclusi anche campioni di controllo sani indipendenti dello stesso tipo di cellula (CD34+). ARV-825, BRD4 inibitore
di Recente whole-genome-wide studi di sequenziamento dei campioni di pazienti con sindromi mielodisplastiche hanno rivelato frequenti mutazioni somatiche in un gruppo chiave di spliceosoma proteine associate, tra cui Serina/ricchi di arginina fattore di splicing 2 (SRSF2) e fattore di Splicing U2AF 35 kDa subunità.
(U2AF1). Queste mutazioni provocano il mis-splicing di centinaia di trascrizioni ., Dato il lavoro precedente che collega la regolazione U2AF1 e gli eventi di esonizzazione, abbiamo esplorato se questi tipi di mutazioni possono aiutare a spiegare la soppressione dell’esonizzazione osservata nei dati del paziente. Per indagare questa possibilità, abbiamo analizzato i dati GRO-seq da una linea cellulare HEK-293 che esprime fattori di splicing wild-type (SRSF2 o U2AF1) o mutanti con (SRSF2(P95H), U2AF1(Q157P)) e senza (U2AF1(S34F)) guadagno di mutazioni della funzione di splicing . Questa analisi ha rivelato che sia la mutazione P95H all’interno di SRSF2 che la mutazione Q157P all’interno di U2AF1 hanno inibito il tasso di inclusione di nuovi esoni (Fig., 5c, p < 1.46 × 10-03, Wilcox-rank sum test, rispetto ai controlli) mentre l’S34F in U2AF1 ha avuto scarso effetto. Per indagare se questi cambiamenti riflettono il carico mutazionale dei campioni di pazienti MDS, abbiamo raggruppato questi dati insieme in base alle mutazioni genomiche all’interno dei loro RBPS. In accordo con i dati delle linee cellulari, questa analisi ha rivelato una stratificazione di esonizzazione basata sul tipo di mutazione genomica RBP (Fig. 5d e file aggiuntivo 1: Figura S5).,
Per indagare se questa soppressione dell’esonizzazione in cAML potrebbe essere alleviata diminuendo il tasso di allungamento trascrizionale, abbiamo valutato l’impatto del farmaco ARV–825, che è noto per inibire l’allungamento RNAPII promuovendo la degradazione della proteina 4 contenente Bromodominio (BRD4) . L’analisi di campioni di pazienti cAML ha replicato i nostri risultati precedenti mostrando la soppressione dell’esonerazione (Fig. 5 e). È importante sottolineare che questa soppressione viene invertita dopo l’applicazione di inibitori BRD4 con un aumento di 12 volte del numero di eventi di esonerazione rilevati (Fig., 5e, p< 4.86 × 10-91, prova ipergeometrica). Complessivamente, questo suggerisce nei tumori del sangue gli eventi di esonizzazione all’interno dei geni del ciclo cellulare sono soppressi ma possono essere fortemente invertiti dall’intervento farmacologico che aumenta la “finestra di opportunità”.
