interazioni della glicoproteina della busta nell’assemblea di coronavirus

I coronavirus sono assemblati germogliando nelle membrane lisce del compartimento intermedio di ER-a-Golgi. Abbiamo studiato l’associazione delle glicoproteine di membrana virali M e S nella formazione dell’involucro del virione. Utilizzando l’analisi di coimmunoprecipitazione abbiamo dimostrato che le proteine M e S del virus dell’epatite del topo (MHV) interagiscono specificamente formando complessi eteromultimerici nelle cellule infette., Questi potrebbero essere rilevati solo quando i detergenti utilizzati per la loro solubilizzazione da cellule o virioni sono stati scelti con cura: una combinazione di detergenti non ionici (NP-40) e ionici (acido desossicolico) si è rivelata ottimale. Gli esperimenti di pulse-chase hanno rivelato che le proteine M e S appena fatte si sono impegnate in una formazione complessa con cinetica diversa. Mentre la proteina M è apparsa in complessi immediatamente dopo la sua sintesi, la proteina S appena sintetizzata lo ha fatto solo dopo una fase di ritardo di > 20 min., M appena fatto è stato incorporato in particelle virali più velocemente di S, il che suggerisce che si associa a molecole S preesistenti. Utilizzando il virus vaccinia T7-driven coespressione di M e S dimostriamo anche la formazione di complessi M/S in assenza di altre proteine coronavirali. Le etichette Pulse-chase e le analisi di coimmunoprecipitazione hanno rivelato che M e S si associano nelle membrane pre-Golgi perché la forma non glicosilata di M è apparsa rapidamente nei complessi M/S., Poiché non è stata rilevata alcuna associazione di M e S quando l’esportazione di proteine dal pronto soccorso è stata bloccata da brefeldin A, i complessi stabili si presentano molto probabilmente nel compartimento intermedio ER-Golgi. L’analisi del gradiente di velocità del saccarosio ha mostrato che i complessi M/S sono eterogenei e di ordine superiore, suggerendo che sono mantenuti da interazioni omo – ed eterotipiche. Complessi M/S colocalizzati con alfa-mannosidasi II, una proteina residente del Golgi. Hanno acquisito modificazioni oligosaccaridiche Golgi-specifiche ma non sono state rilevate sulla superficie cellulare., Pertanto, la proteina S, che su se stessa è stata trasportata alla membrana plasmatica, è stata trattenuta nel complesso di Golgi dalla sua associazione con la proteina M. Poiché i coronavirus germogliano a membrane pre-Golgi, questo risultato implica che i complessi glicoproteici della busta non determinano il sito di germogliamento. Tuttavia, l’auto-associazione delle glicoproteine dell’involucro MHV in complessi di ordine superiore è indicativa del suo ruolo nello smistamento delle proteine della membrana virale e nel guidare la formazione del rivestimento lipoproteico virale nell’assemblaggio del virus.