Frequenza di CCR5 Delta 32 Mutazione nel Virus dell’Immunodeficienza Umana (HIV)-sieropositivi e HIV-esposti Sieronegativi e, in Generale, la Popolazione di Medellin, Colombia

Francisco J Diaz, Jorge Vega, Paul J Patiño*, Gabriele Bedoya,
Jorge Nagles**, Cecilia Villegas**, Rodrigo Vesga***, Maria T Rugeles/+

Virologia Laboratorio *Laboratorio di Immunologia, Dipartimento di Microbiologia e Parassitologia della Facoltà di Medicina, Universidad de Antioquia, AA 1226, Medellin, Colombia **Istituto di Assicurazione Sociale, Medellin, Colombia ***Istituto Metropolitan Health, Medellin, Colombia

Ripetuta esposizione al virus dell’immunodeficienza umana (HIV) non sempre risulta in sieroconversione., Le modifiche nei corecettori per l’ingresso dell’HIV nelle cellule bersaglio sono uno dei fattori che bloccano l’infezione. Abbiamo studiato la frequenza della mutazione Delta-32 nel gene ccr5 a Medellin, in Colombia. Duecentodiciotto individui distribuiti in tre diversi gruppi sono stati analizzati per la mutazione Delta-32 nel gene ccr5 mediante reazione a catena della polimerasi( PCR): 29 sieropositivi HIV (SP), 39 sieronegativi esposti (ESN) e 150 individui come campione di popolazione generale (GPS). La frequenza dell’allele mutante Delta-32 era del 3,8% per ESN, del 2,7% per GPS e dell ‘ 1,7% per SP., Solo un genotipo mutante omozigote (Delta-32 / Delta-32) è stato trovato tra l’ESN (2,6%). Il genotipo eterozigote (ccr5 / Delta-32) è stato trovato in otto GPS (5,3%), in un SP (3,4%) e in un ESN (2,6%). Le differenze nelle frequenze alleliche e genotipiche tra i tre gruppi non erano statisticamente significative. Un confronto tra le frequenze genotipiche attese e osservate ha mostrato che queste frequenze erano significativamente diverse per il gruppo ESN, il che suggerisce indirettamente un effetto protettivo del genotipo mutante (Delta-32/Delta-32)., Poiché questo genotipo mutante ha spiegato la resistenza dell’infezione solo in una delle nostre persone ESN, diversi meccanismi di protezione devono svolgere un ruolo più importante in questa popolazione.,

parole Chiave: CCR5 Delta 32 mutazione del virus dell’immunodeficienza umana (HIV) – esposti sieronegativi

dall’inizio della sindrome da immunodeficienza acquisita (Aids) epidemia, è stato stabilito che l’attività sessuale con partner multipli è stato il principale fattore di rischio di acquisire il virus dell’immunodeficienza umana (HIV), con il conseguente sviluppo dell’Aids., Tuttavia, ci sono forti prove che suggeriscono una resistenza naturale all’infezione in diversi individui che sono rimasti non infetti nonostante il fatto che abbiano avuto diverse esposizioni all’HIV, in particolare attraverso rapporti sessuali (Paxton et al. 1996). La base biologica di questa resistenza sta appena iniziando a essere compresa.

Per entrare nella cellula bersaglio l’HIV richiede la presenza della molecola CD4 che funge da recettore e di una seconda molecola o corecettore, che nella maggior parte dei casi è un recettore della chemochina (Deng et al. 1996, Feng et al. 1996)., Tra i recettori della chemochina, CCR5 e CXCR4 sono i principali corecettori per l’ingresso dell’HIV.

Quasi contemporaneamente alla scoperta dei corecettori dell’HIV, è stata descritta una mutazione nel gene che codifica per la molecola CCR5, che conferisce un alto grado di resistenza all’infezione da HIV in vitro e in vivo (Paxton et al. 1996, Liu et al. 1996). Questa mutazione denominata Delta-32 consiste in una delezione di 32 coppie di basi che codifica per una proteina non funzionale e, di conseguenza, non è espressa nella membrana cellulare., Gli individui omozigoti per questa mutazione non hanno alcuna alterazione immunologica o biologica nota (Liu et al. 1996).

L’allele Delta-32 è presente principalmente nella popolazione caucasica (Liu et al. 1996, Martinson et al. 1997, Magierowska et al. 1998). Negli Stati Uniti la frequenza è 8% a 10% nella popolazione bianca, ma meno di 1% in individui afro-americani. C’è anche una frequenza molto bassa della mutazione tra i caucasici in Asia (Pakistan e India) e non è stata riportata in Cina, Giappone o popolazione africana pura (Martinson et al. 1997)., In America Latina le frequenze sono state appena studiate. Non è stato rilevato tra 32 individui provenienti dal Venezuela né in gruppi amerindi (Liu et al. 1996, Martinson et al. 1997). In Colombia non ci sono rapporti che affrontano questo problema.

In individui sessualmente esposti all’HIV ma sieronegativi (ESN), la frequenza del genotipo Delta-32 / Delta-32 raggiunge il 2,8% al 3,6%, che corrisponde a due o tre volte la frequenza riscontrata nella popolazione caucasica non esposta (Dean et al. 1996, Huang et al. 1996)., Questa frequenza può arrivare fino al 33% nelle persone con più alto rischio di infezione (Huang et al. 1996). Al contrario, gli individui infetti da HIV mostrano la frequenza più bassa dell’allele Delta-32. È stato considerato che gli individui con genotipo mutante omozigote (Delta-32 / Delta-32) erano 100% resistenti all’infezione da HIV, almeno con ceppi M-tropici, che utilizza la molecola CCR5 come corecettore. Tuttavia, recentemente ci sono state segnalazioni di infezione da HIV in due individui che sono omozigoti per l’allele mutante (Delta-32/Delta-32) (Biti et al. 1997)., Queste infezioni potrebbero essersi verificate con ceppi T-tropici che utilizzano la molecola CXCR4 come corecettore per entrare nelle cellule bersaglio.

È stato difficile stabilire se il genotipo ccr5 / Delta-32 conferisca un grado di resistenza alle infezioni. Gli studi su questo aspetto sono contraddittori (Samson et al. 1996, Dean et al. 1996, Huang et al. 1996, Hoffman et al. 1997).,

Dalla letteratura si può concludere che il genotipo Delta-32 / Delta-32 conferisce un alto grado di protezione all’infezione da HIV, ma non è il principale fattore associato alla resistenza, poiché la maggior parte di ESN manca di questo fattore genetico. Meccanismi diversi come altre mutazioni dei corecettori o fattori immunologici potrebbero spiegare la mancanza di infezioni in questo gruppo ad alto rischio.,

Questo studio è stato condotto per valutare la frequenza di Delta-32 allele e i genotipi per il gene ccr5 in diversi sottogruppi: ESN, sieropositivi e della popolazione generale al fine di esplorare l’influenza di questo fattore genetico nel comportamento dell’infezione da HIV nel nostro paese.,

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

MATERIALS AND METHODS

Population -The study was carried out in three groups of individuals., ESN: persone con anamnesi di rapporti sessuali ripetuti senza protezione con soggetti infetti da HIV. Il numero di soggetti in questo gruppo è vicino all’universo conosciuto ESN nella nostra città; SP: tutte le persone in questo gruppo erano presenti i partner sessuali di ESNs che avevano anticorpi anti-HIV e alcuni di loro, inoltre, presenta segni clinici di infezione da HIV; GPS: questa popolazione erano volontari adulti, la maggior parte dei loro studenti e lavoratori dal nostro istituto o istituti sanitari correlati alla nostra università. Nessuno di loro è stato selezionato in base al rischio di infezione da HIV., Lo stato sierologico dell’HIV per le persone in questo gruppo non è stato determinato.

Stato sierologico-Lo stato sierologico per gli individui nel gruppo ESN è stato confermato da un test ELISA (Enzygnost HIV-1+2 Plus, Behring Diagnostics, Margurg, Germania).

Determinazione del genotipo-La determinazione del genotipo è stata effettuata come descritto in precedenza (Michael et al. 1997). In breve, il campione di sangue periferico è stato raccolto con EDTA come anticoagulante. Le cellule mononucleate sono state separate dal gradiente Ficoll-Hypaque., Parte delle cellule è stata crioconservata per futuri studi funzionali. Le cellule rimanenti sono state utilizzate per l’estrazione del DNA utilizzando la tecnica fenolo-cloroformio. Il segmento specifico del gene ccr5 è stato amplificato dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando i seguenti primer: CCR5-Delta1 (5′-ACCAGATCTCAAAAGAAGGT CT-3′) e CCR5-Delta-2 (5′-CATGATGTGAAG ATAAGCCTCACA-3′). La reazione conteneva 5 pmol di ciascun primer, 0,3 unità di Taq DNA polimerasi (Perkin-Elmer), 2 mm di MgCl2 e 200 µM di ciascun dNTP in un volume finale di 25 µl., La reazione è stata sottoposta a 30 cicli di amplificazione con tre temperature 96 ° C x 15 sec, 58 ° C x 60 sec e 72°C x 60 sec. Il risultato dell’amplificazione è stato elettroforizzato in un gel di agarosio al 2%, colorato con bromuro di etidio e visualizzato sotto transilluminazione U. V. Per il genotipo selvaggio (ccr5 / ccr5) il prodotto PCR era di 225 bp mentre un prodotto di 193 bp indicava un omozigote mutante (Delta-32/Delta-32). La presenza di entrambe le bande ha indicato un genotipo eterozigote (ccr5 / Delta-32) (Figura).,

Analisi statistica-Le frequenze alleliche e genotipiche trovate sono state confrontate e le differenze valutate utilizzando il test chi quadrato (chi2). Le differenze tra le frequenze previste e osservate dei genotipi sono state valutate dallo stesso test.

RISULTATI

Abbiamo studiato 218 individui divisi in tre gruppi: ESN, SP e GPS. La loro distribuzione e il loro profilo demografico sono mostrati nella tabella I. Tutti i gruppi avevano una media di età simile., I gruppi GPS e ESN avevano una distribuzione di genere simile ma diversa dal gruppo SP in cui i maschi erano predominanti. La maggior parte delle coppie erano eterosessuali e pochi di loro erano omosessuali o individui non pared con preferenze bisessuali. Tutti i soggetti sieropositivi avevano acquisito l’infezione attraverso un rapporto sessuale.

Le frequenze del genotipo sono mostrate nella Tabella II. La frequenza più alta era per il genotipo selvaggio (ccr5+ / ccr5). Il genotipo eterozigote (ccr5 + / Delta-32) è stato trovato in otto GPS, in uno SP e in un ESN., Solo un genotipo mutante omozigote (Delta-32/Delta-32) è stato trovato tra l’ESN (Figura). La differenza nelle frequenze tra i tre gruppi studiati non era statisticamente significativa. Le frequenze alleliche per ccr5 e Delta-32 sono mostrate nella Tabella III. La frequenza dell’allele mutante Delta-32 era del 3,8% per ESN, del 2,7% per GPS e dell ‘ 1,7% per SP. Le differenze non erano statisticamente significative.

In base alle frequenze alleliche di ciascun gruppo è possibile prevedere la frequenza del genotipo considerando che seguono l’equilibrio di Hardy-Weinberg., Il che significa che le frequenze hanno una distribuzione binomiale, secondo la seguente equazione: p2 + 2pq + q2 = 1, dove p e q sono le frequenze alleliche di ccr5+ e Delta-32, rispettivamente, e p2, 2pq e q2 sono le frequenze del genotipo di ccr5+/ccr5+, ccr5+/Delta-32 y Delta-32/Delta-32, rispettivamente. Un confronto tra le frequenze genotipiche attese e osservate è mostrato nella Tabella IV., In SP e GPS le frequenze osservate sono simili a quelle attese, mentre nel gruppo ESN la frequenza osservata differiva significativamente dalla frequenza attesa allontanandosi dall’equilibrio di Hardy-Weinberg (p<0.0005).

Poiché il numero di individui nel gruppo ESN e la frequenza di Delta-32 erano bassi, non è stato possibile stabilire una relazione tra il genotipo ccr5 e alcuni comportamenti a rischio come la frequenza dell’uso del preservativo, il tipo di relazione sessuale e il tempo di esposizione., L’unica persona con un genotipo omozigote mutante era una donna che aveva una relazione sessuale stabile per tre anni con una media di otto rapporti sessuali non protetti al mese con il marito infetto. Il soggetto con genotipo eterozigote trovato in questo gruppo corrisponde ad un uomo bisessuale promiscuo che aveva rapporti sessuali frequentemente anali durante sette mesi con una coppia infetta.,

DISCUSSIONE

composizione etnica della popolazione Colombiana, è un prodotto di una miscela di Europei, Africani e Indiani nativi. Il contributo dell’Europa è principalmente spagnolo (Bravo et al. 1996). Due segnalazioni di frequenza Delta-32 nella popolazione spagnola hanno mostrato una frequenza allele dell ‘8,6% (95% CI 4,9-12,3%) nei baschi, dell’ 8,2% (95% CI 5,4-10,9%) nei catalani e del 5% (95% CI 2,0-8,0%) negli individui di San Sebastian (Martinson et al. 1997, Magierowska et al. 1998).,

Nel nostro studio la frequenza di Delta-32 per il gruppo GPS era del 2,7% (95% CI 0,90 – 4,5%). In base a questo risultato potremmo calcolare che la componente spagnola del GPS è vicina o addirittura inferiore al 50%. Questa stima è diversa da un precedente rapporto di Bravo et al. (1996), in cui utilizzando un pannello di diversi marcatori genetici hanno osservato una prevalenza della componente europea rispetto alle altre razze nella popolazione della nostra provincia (Antioquia)., Poiché il campione GPS non includeva solo persone nate ad Antioquia ma residenti di questa provincia, è possibile che un numero significativo di individui inclusi in questo gruppo siano nati in diverse province in cui l’influenza della razza europea non è nota. Questo fatto potrebbe spiegare la bassa prevalenza osservata di Delta-32.

Sebbene questo studio abbia rilevato una maggiore prevalenza di allele Delta-32 e genotipo Delta-32 / Delta-32 tra ESN, le differenze nelle frequenze non erano significative (Tabelle II, III)., Probabilmente la ridotta dimensione del campione non ha permesso di mostrare un’associazione significativa tra genotipo e infezione.

In assenza di selezione positiva e negativa o di altri fattori come frequenti migrazioni recenti, alto tasso mutazionale o alto indice di endogamia, la distribuzione dei genotipi in ciascun gruppo deve essere simile ai valori previsti dopo la distribuzione di Hardy-Weinberg. Il GPS ha mostrato una distribuzione genotipica in equilibrio., Poiché la circolazione dell’HIV è un fattore di selezione, questo fatto potrebbe avere due spiegazioni: la frequenza del genotipo protettivo Delta-32/Delta-32 è troppo bassa per essere percepibile, o il grado di esposizione all’HIV è ancora basso in questa popolazione. Conoscendo la frequenza dell’allele Delta-32, abbiamo calcolato la frequenza del genotipo Delta-32/Delta-32 come 0,00071. Ciò significa che solo una persona su 1406 individui avrebbe portato il genotipo omozigote mutante (Delta-32/Delta-32).

La distribuzione dei genotipi in SP è anche secondo l’equilibrio di Hardy-Weinberg., La spiegazione di questo fatto in questo gruppo è più difficile, dal momento che tutti gli individui sono stati sessualmente esposti all’HIV e questo deve aver selezionato positivamente il genotipo selvaggio ccr5+/ccr5+. È possibile che la rapida evoluzione verso l’Aids e la morte di individui portatori di genotipi selvatici sull’eterozigote possano compensare questo effetto, ma ancora una volta la bassa frequenza dell’allele Delta-32 rende difficile l’analisi.,

La mancanza di equilibrio nelle frequenze genotipiche tra l’ESN era altamente significativa a causa della presenza di un individuo con il genotipo Delta-32 / Delta-32. Ciò rende la frequenza 17 volte superiore al previsto (Tabella IV). Questa scoperta è difficilmente spiegabile con uno dei seguenti argomenti che possono anche contribuire a rompere l’equilibrio Hardy-Weinberg in una popolazione: recente immigrazione europea e endogamia, dal momento che questi fatti non si trovano frequentemente tra la nostra popolazione. Anche il tasso di mutazione per questa mutazione non dovrebbe essere elevato., Anche la possibilità che questa distribuzione si sia verificata casualmente è molto bassa (p<0.0005). La selezione positiva di individui con tale genotipo Delta-32 / Delta-32 tra ESN è la spiegazione più plausibile per la mancanza di equilibrio. Pertanto, l’effetto protettivo di questo genotipo è stato mostrato, anche se indirettamente.

Nel nostro studio la frequenza del genotipo Delta-32 / Delta-32 spiega solo la resistenza alle infezioni in una percentuale molto bassa di individui ESN (2,6%)., Questo è concorde con altri studi che hanno mostrato risultati simili (Bernard et al. 1999). Poiché molti degli individui del gruppo ESN hanno avuto un alto grado di esposizione all’HIV, ci devono essere altri meccanismi responsabili di questa “protezione naturale”. Recentemente, è stato dimostrato che l’HIV potrebbe utilizzare altri recettori chemochine come CCR2 e CCR3 come correttori (Berger et al. 1999). Pertanto, mutazioni in queste molecole o nei ligandi dei recettori della chemochina potrebbero spiegare la resistenza all’infezione da HIV di alcuni individui., Tuttavia, la mutazione CCR2-64I, non è stata associata a un fenotipo resistente, ma piuttosto a un ritardo nella progressione della malattia (Smith et al. 1997). Allo stesso modo, il polimorfismo SDF-1-3’a riportato nell’alfa-chemochina SDF-1 è stato associato al ritardo nell’insorgenza dei sintomi correlati all’Aids (Winkler et al. 1998). Altri geni del sistema immunitario come quelli del sistema HLA sembrano influenzare anche la progressione della malattia, anche se gli effetti sono complessi e possono dipendere dalle interazioni con altri geni ospiti (McNicholl et al. 1997)., Risposte immunitarie cellulari specifiche, in particolare mediate da cellule T citotossiche o risposte umorali a livello mucoso, sono state dimostrate in soggetti sieronegativi esposti (Mazzoli et al. 1997), indicando che l’immunità acquisita potrebbe essere il meccanismo responsabile del controllo dell’infezione in questi individui. L’importanza relativa di questi meccanismi in popolazioni con diverse modalità di esposizione o background genetico devono essere chiariti

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Fig. / Table I | Table II | Table III/Table IV

Questo lavoro ha ricevuto un sostegno finanziario dall’Università di Antioquia e dal Banco de la Republica.

+ Autore corrispondente. Fax: + 57-4 510 6062. E-mail: [email protected].,co

Received 26 August 1999

Accepted 4 January 2000