7.25.5.4 Dalla diffusione alla perfusione
Tuttavia, la capacità di diffusione limita la profondità massima del tessuto in patch cardiaci che sono progettati secondo entrambi i principi, e malnutrizione e ipossia possono diminuire la vitalità delle regioni centrali di un patch cardiaco71,96,101 Per i modelli che usano le più alte densità iniziali delle cellule con conseguente aggregato multicellulare compatto, una profondità massima del tessuto di ~100-200 µm è stata proposta dagli autori multipli., Nelle colture multistrato cardiomiocitarie più estreme e prive di scaffold, prodotte con un metodo denominato cell sheet engineering, possono verificarsi limitazioni di diffusione a uno spessore molto basso dell’assemblaggio, con un conseguente spessore massimo anche inferiore a 100 µm.,101 Tuttavia, è improbabile che un cerotto cardiaco sviluppi mai le forze attive desiderate per un aumento in vivo della funzione cardiaca, né sopporterà le forze che vengono periodicamente caricate sulle varie regioni della parete miocardica in vivo, a meno che le attuali drammatiche limitazioni sulle dimensioni fisiche del cerotto non siano superate da nuove modifiche agli attuali approcci di produzione, in particolare le limitazioni riguardanti lo spessore del tessuto., A tal fine, uno spessore maggiore del tessuto in crescita può essere ottenuto con diversi metodi, tra cui (1) mirare a una densità cellulare inferiore nel cerotto finale, (2) utilizzando uno scaffold con pori medi più grandi, (3) installando un sistema di convezione media o anche una vera perfusione tramite una rete vascolare e (4) aggiunta di ulteriori tipi di cellule, come le cellule endoteliali e le cellule interstiziali., I concetti delle categorie (1) e (2) possono risultare in un tessuto più spesso, ma si prevede che i risultati funzionali si deteriorino perché le caratteristiche dello scaffold potrebbero superare l’impatto delle cellule inoculate.
Seguendo il concetto (3), una serie di bioreattori sono stati testati da vari gruppi al fine di aumentare la qualità dei cerotti cardiaci ingegnerizzati in vitro. Nei primi studi, una convezione media sulle superfici esterne del cerotto ha già portato a un risultato migliore.,71 La vitalità cellulare, il contenuto cellulare totale e i marcatori di differenziazione cardiaca sono stati migliorati e questi effetti possono anche essere ulteriormente migliorati dall’installazione di una vera perfusione. Tuttavia, un modello di perfusione veramente fisiologico dipende da un’enorme capacità capillare, e una densità capillare come è presente in vivo potrebbe non essere realizzabile in vitro a causa di limitazioni tecniche assumibili. In particolare, la distanza media dei vasi capillari nel tessuto miocardico nativo varia nell’ordine di soli 15-20 µm.,102 Tuttavia, lontano da questo livello ideale di perfusione, un singolo vaso centrale in un costrutto cardiomiocitario 3D può fornire la piattaforma strutturale per un miglioramento significativo della vitalità e della funzione cellulare quando il mezzo di coltura viene pompato attraverso di esso.103 Utilizzando tecniche di imaging dirompente, una correlazione spaziale della vitalità con il livello di perfusione può diventare visibile, il che dimostra l’effetto benefico sorprendente di modifiche relativamente semplici a un modello in vitro., Inutile dire che, insieme e anche oltre la pura sopravvivenza dei cardiomiociti, una vasta gamma di parametri funzionali dipende fortemente dalla perfusione tissutale.104 Di conseguenza, l’estensione di una nave centrale a più navi è stata tentata in diversi studi.105-107 Un cerotto cardiaco che si basa su un materiale sintetico poroso contenente diversi canali di penetrazione dello scaffold è stato seminato con cardiomiociti per ottenere una migliore distribuzione cellulare spaziale e la conservazione dei marcatori di cardiomiociti maturi., Tuttavia, nonostante gli apparenti cambiamenti positivi riguardanti la nutrizione e l’apporto di ossigeno nelle regioni centrali dei cerotti cardiaci spessi 2 mm, è difficile ottenere una massa cellulare compatta di profondità notevolmente maggiore di 100 µm, anche nel caso dell’uso di scaffold canalizzati.105 Come passo logico successivo, sono state valutate strutture più delicate per la loro idoneità come sostituti di una rete vascolare., La ramificazione e la raccolta di insiemi di strutture tubolari interconnesse con diametri più piccoli creati nell’intervallo di 60-120 µm si sono dimostrati accessibili alle tecniche di reendotelializzazione in vitro.108 Apparentemente, il progresso tecnologico in corso spinge continuamente i limiti per la miniaturizzazione di componenti strutturali biocompatibili, come reti vascolari e modelli ECM.,109 Esperimenti di scaffold micropatterned non solo hanno esteso la nostra comprensione dell’interrelazione tra morfologia e funzione, ma hanno anche aperto un nuovo percorso alla manipolazione in vitro e alla generazione di substrati viventi multicellulari.108-112 Se questa tendenza nel downscaling sperimentale sarà guidata da un continuo trasferimento della tecnologia coinvolta nella pratica clinica rimane speculativo. Dal punto di vista clinico, nel caso di un cerotto cardiaco canalizzato alcune limitazioni che possono essere sperimentate nella sostituzione di una struttura portante della funzione di barriera del sangue (ad es.,, parete del setto tra due camere ventricolari o la parete ventricolare libera) devono essere affrontati. Più impegnativo, nel caso di un albero vascolare miniaturizzato, una connessione di tutti i canali a una singola rete e il collegamento di questa rete alla circolazione sanguigna giustificano ulteriori nuove strategie prima che questi costrutti possano essere valutati in vivo in studi a lungo termine. Nonostante queste preoccupazioni, i principi convincenti che vengono evidenziati da questi esperimenti hanno stabilito nuovi standard per la generazione di un cerotto cardiaco bioartificiale.,
Un altro approccio che mira a stabilire la perfusione tissutale funzionale si basa sulla conservazione e l’impiego di una rete vascolare nativa intatta dopo la rimozione selettiva dei componenti cellulari circostanti. Questo metodo è stato sviluppato negli ultimi due decenni e si è diffuso tra varie discipline come decellularizzazione.113 Tuttavia, il campo dell’ingegneria tissutale miocardica ha ricevuto poca attenzione, rispetto a lavori scientifici simili con particolare attenzione ad altri tipi di tessuti o sistemi di organi, ad esempio,, ingegneria urologica del tessuto o ingegneria del tessuto della valvola cardiaca.114-117 Ma recentemente, la decellularizzazione ha sperimentato una rinascita come strumento magico per aggirare gli enormi problemi che attualmente limitano i concetti di ingegneria dei tessuti molli. Mediante l’applicazione controllata di una serie di soluzioni detergenti bilanciate, è possibile un’interruzione delle giunzioni cella–cella e cella–ECM con modifiche accettabili all’ECM. Questo principio è stato applicato a molti tessuti e frammenti di organi, tra cui vescica urinaria, piccola sottomucosa intestinale, muscolo scheletrico, vasi arteriosi e valvole cardiache.,118-121 In un recente studio, la perfusione di un cuore di roditore con soluzioni detergenti ha portato a un cuore intero decellularizzato che di conseguenza è servito da modello per l’ingegneria del tessuto cardiaco. Mediante iniezione multifocale di cardiomiociti neonatali di ratto, si può ottenere un’attività contrattile macroscopica che contribuisce alla generazione di forza rilevabile., Questo modello preliminare di un cuore intero tessuto ingegnerizzato è stato caratterizzato a livello istologico, biologico molecolare e elettrofisiologico e i risultati in vitro aumentano l’entusiasmo per il futuro dell’ingegneria dei tessuti cardiaci. Ancora più importante, questo modello comprende già una rete vascolare di alta qualità in termini di distribuzione dei vasi in tutto il ponteggio (Fig. 2)., Inoltre, una riduzione regolare e graduale del diametro del vaso che porta sul lato arterioso dall’aorta in scala millimetrica fino ai capillari in scala micrometrica e il ritorno sul lato venoso dai capillari all’atrio destro sono i principali vantaggi dell’origine nativa dello sviluppo delle scaffold decellularizzate.122 Tuttavia, occorre prestare attenzione a mantenere la pervietà delle strutture capillari, in quanto potrebbero essere ostruite da detriti cellulari durante il processo di lavaggio lungo la decellularizzazione., Una valutazione pratica può essere eseguita mediante perfusione del sistema coronarico mediante iniezione di colorante indicatore nella radice aortica del cuore decellularizzato (Fig. 3). Tuttavia, una valutazione quantitativa della pervietà delle microvasculature è più impegnativa e richiede una notevole quantità di lavoro investigativo al fine di stabilire risultati validi e riproducibili. Inoltre, occlusione trombotica durante il successivo ripopolamento transluminale (ad es.,, l’applicazione di cellule endoteliali attraverso la vascolarizzazione coronarica) o durante la perfusione in vivo con sangue intero deve essere prevenuta, e studi più dettagliati devono dimostrare la riproducibilità e l’efficacia della perfusione mantenuta in condizioni in vivo.123-125 Tuttavia, la prova di concetto è l ‘ 122 e i dati provenienti da studi correlati su impianti cardiovascolari decellularizzati suggeriscono la fattibilità di misure anti-trombotiche innate attraverso la modifica dei protocolli di decellularizzazione., A tal fine, una ECM miocardica decellularizzata spazia tra i primi scaffold candidati per la creazione di un cerotto cardiaco, in quanto soddisfa diversi prerequisiti generali: (i) biocompatibilità, (ii) stabilità biomeccanica, (iii) vascolarizzazione e (iv) potenziale di interazione biologica e rimodellamento.116 Gli studi in corso dimostreranno in ultima analisi il valore in vivo di questo approccio.
Fig. 2. Vista macroscopica di un cuore di ratto decellularizzato detergente con macrovasculatura conservata., L’aorta ascendente è etichettata con asterischi; le frecce indicano l’arteria discendente anteriore sinistra (LAD). LA, appendice atriale sinistra; RVOT, tratto di deflusso ventricolare destro.
Fig. 3. Valutazione grossolana della pervietà della macrovascolarizzazione coronarica. L’aorta ascendente (asterisco) viene intubata con una canula e una soluzione colorante viene iniettata per perfondere il sistema vascolare coronarico in modo antegrade per dimostrare la macrovascolarizzazione coronarica conservata., La freccia indica l’arteria discendente anteriore sinistra (LAD).
Secondo altre strategie con l’obiettivo di superare i limiti dimensionali nell’ingegneria del cerotto cardiaco, viene promossa la formazione in vitro di strutture simili a capillari da parte delle cellule endoteliali e dei loro progenitori. Utilizzando uno scaffold liquido e una miscela di cellule cardiache ed endoteliali, una riorganizzazione spontanea in vitro di entrambi i principali tipi di cellule è stata osservata da diversi gruppi.,23.126 Strutture tubolari derivate da cellule endoteliali che possono assomigliare a strutture primitive simili a capillari sono state osservate in scaffold sintetici e biologici durante la coltura in vitro. Sebbene le rispettive strutture rappresentino singole entità in localizzazione sciolta e dispersa senza una continuità uniforme, sono state considerate come surrogati di una predisposizione vascolare con la possibilità di finalizzare la maturazione su applicazione in vivo.126 Quest’ultimo aspetto è dimostrato da studi che hanno coinvolto un modello di impianto cardiaco in roditori, 100 che sono ulteriormente discussi nel Paragrafo 7.25.,5.2. Ma indipendentemente dalla possibilità di un’eventuale connessione di questi capillari primitivi alla circolazione sistemica, c’è un crescente corpo di prove a sostegno dell’ipotesi che una vasta gamma di effetti biologici sui cardiomiociti e sulle cellule interstiziali possa essere innescata dalla frazione di cellule endoteliali in un cerotto cardiaco in crescita. L’aggiunta di EC supporta il mantenimento di uno stato differenziato, rappresenta un fattore prosurvival e aumenta le prestazioni funzionali dei cerotti cardiaci.,23,127 Sorprendentemente, sebbene siano stati impiegati diversi materiali di scaffold biologici e sintetici con microstruttura variabile, l’effetto di questa strategia sul risultato in termini di vitalità cellulare ottimizzata e attività contrattile è stato relativamente alto, suggerendo un ruolo protettivo indipendente per le coculture di EC in un cerotto cardiaco.
