Frecuencia de mutación CCR5 Delta-32 en individuos seropositivos y seronegativos expuestos al VIH y en población general de Medellín, Colombia

Francisco J Díaz, Jorge A Vega, Pablo J Patiño*, Gabriel Bedoya,
Jorge Nagles**, Cecilia Villegas**, Rodrigo Vesga***, Maria T Rugeles/+

Laboratorio de Virología *Laboratorio de Inmunología, Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, AA 1226, Medellin, Colombia **Instituto de los Seguros Sociales, Medellin, Colombia ***Instituto Metropolitano de Salud, Medellin, Colombia

Repeated exposure to human immunodeficiency virus (HIV) does not always result in seroconversion., Las modificaciones en los coreceptores para la entrada del VIH a las células diana son uno de los factores que bloquean la infección. Estudiamos la frecuencia de la mutación Delta-32 en el gen ccr5 en Medellín, Colombia. Se analizaron doscientos dieciocho individuos distribuidos en tres grupos diferentes para la mutación Delta-32 en el gen ccr5 por reacción en cadena de la polimerasa (PCR): 29 seropositivos al VIH (SP), 39 seronegativos expuestos (ESN) y 150 individuos como muestra de población general (GPS). La frecuencia del alelo mutante Delta-32 fue de 3,8% para ESN, 2,7% para GPS y 1,7% para SP., Solo se encontró un genotipo mutante homocigoto (Delta-32 / Delta-32) entre la ESN (2,6%). El genotipo heterocigoto (CCR5 / Delta-32) se encontró en ocho GPS (5,3%), en un SP (3,4%) y en un ESN (2,6%). Las diferencias en las frecuencias alélicas y genotípicas entre los tres grupos no fueron estadísticamente significativas. Una comparación entre las frecuencias genotípicas esperadas y observadas mostró que estas frecuencias fueron significativamente diferentes para el grupo ESN, lo que sugiere indirectamente un efecto protector del genotipo mutante (Delta-32/Delta-32)., Dado que este genotipo mutante explica la resistencia a la infección en solo una de nuestras personas con ESN, diferentes mecanismos de protección deben estar jugando un papel más importante en esta población.,

Palabras Clave: mutación CCR5 – Delta-32 – infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) – exposición seronegativa

desde el inicio de la epidemia del síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), se determinó que la actividad sexual con múltiples parejas era el principal factor de riesgo para adquirir la infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) con el posterior desarrollo del sida., Sin embargo, existe una fuerte evidencia que sugiere una resistencia natural a la infección en varios individuos que han permanecido no infectados a pesar del hecho de que han tenido varias exposiciones al VIH, particularmente a través de las relaciones sexuales (Paxton et al. 1996). La base biológica de esta resistencia está empezando a ser entendida.

para entrar en la célula diana el VIH requiere la presencia de la molécula CD4 que actúa como receptor y de una segunda molécula o coreceptor, que en la mayoría de los casos es un receptor de quimioquinas (Deng et al. 1996, Feng et al. 1996)., Entre los receptores de quimiocinas, CCR5 y CXCR4 son los principales coreceptores para la entrada del VIH.

casi simultáneamente con el hallazgo de coreceptores del VIH, se describió una mutación en el gen que codifica la molécula CCR5, que confiere un alto grado de resistencia a la infección por VIH in vitro e in vivo (Paxton et al. 1996, Liu et al. 1996). Esta mutación llamada Delta-32 consiste en una deleción de 32 pares de bases que codifica para una proteína no funcional, y como resultado no se expresa en la membrana celular., Los individuos homocigotos para esta mutación no tienen ninguna alteración inmunológica o biológica conocida (Liu et al. 1996).

el alelo Delta-32 está presente principalmente en la población caucásica (Liu et al. 1996, Martinson et al. 1997, Magierowska et al. 1998). En Estados Unidos la frecuencia es del 8% al 10% en la población blanca, pero menos del 1% en los individuos afroamericanos. También hay una frecuencia muy baja de la mutación entre los caucásicos en Asia (Pakistán e India) y no se ha reportado en China, Japón o población africana pura (Martinson et al. 1997)., En América Latina las frecuencias apenas han sido estudiadas. No se detectó en 32 individuos de Venezuela ni en grupos amerindios (Liu et al. 1996, Martinson et al. 1997). En Colombia no hay informes que aborden esta cuestión.

en individuos sexualmente expuestos al VIH pero seronegativos (ESN), la frecuencia del genotipo Delta-32/Delta-32 alcanza del 2,8% al 3,6%, lo que corresponde a dos o tres veces la frecuencia encontrada en la población caucásica no expuesta (Dean et al. 1996, Huang et al. 1996)., Esta frecuencia puede llegar hasta el 33% en personas con mayor riesgo de infección (Huang et al. 1996). En contraste, los individuos infectados por el VIH exhiben la frecuencia más baja del alelo Delta-32. Se consideró que los individuos con genotipo mutante homocigoto (Delta-32 / Delta-32) eran 100% resistentes a la infección por VIH, al menos con cepas M-tropic, que utiliza la molécula CCR5 como coreceptor. Sin embargo, recientemente hubo informes de infección por VIH en dos individuos que son homocigotos para el alelo mutante (Delta-32/Delta-32) (Biti et al. 1997)., Estas infecciones podrían haber ocurrido con cepas T-tropic que utilizan la molécula CXCR4 como coreceptor para entrar en las células diana.

ha sido difícil establecer si el genotipo ccr5/Delta-32 confiere algún grado de resistencia a la infección. Los estudios sobre este aspecto son contradictorios (Samson et al. 1996, Dean et al. 1996, Huang et al. 1996, Hoffman et al. 1997).,

de la literatura se puede concluir que el genotipo Delta-32/Delta-32 confiere un alto grado de protección a la infección por VIH, pero no es el principal factor asociado a la resistencia, ya que la mayoría de las ESN carecen de este factor genético. Diferentes mecanismos como otras mutaciones coreceptoras o factores inmunológicos podrían explicar la ausencia de infecciones en este grupo de alto riesgo.,

este estudio se realizó para estimar la frecuencia del alelo Delta-32 y los genotipos para el gen ccr5 en diferentes subgrupos: ESN, seropositivos y población general con el fin de explorar la influencia de este factor genético en el comportamiento de la infección por VIH en nuestro país.,

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

MATERIALS AND METHODS

Population -The study was carried out in three groups of individuals., ESN: personas con antecedentes de relaciones sexuales repetidas sin protección con sujetos infectados por el VIH. El número de sujetos en este grupo es cercano al universo de ESN conocidas en nuestra ciudad; SP: todas las personas incluidas en este grupo eran parejas sexuales de ESN que tenían anticuerpos anti-VIH y algunas de ellas también presentaban signos clínicos de infección por VIH; GPS: esta población eran voluntarios adultos, en su mayoría estudiantes y trabajadores de nuestra institución o instituciones de salud relacionadas con nuestra universidad. Ninguno de ellos se seleccionó en función del riesgo de infección por el VIH., No se determinó el estado serológico del VIH para las personas de este grupo.

estado serológico – el estado serológico de los individuos en el grupo ESN fue confirmado por una prueba ELISA (Enzygnost HIV-1 + 2 Plus, Behring Diagnostics, Margurg, Alemania).

determinación del genotipo – la determinación del genotipo se llevó a cabo como se describió anteriormente (Michael et al. 1997). Brevemente, se recolectó muestra de sangre periférica con EDTA como anticoagulante. Las células mononucleares fueron separadas por gradiente Ficoll-Hypaque., Parte de las células criopreservadas para futuros estudios funcionales. Las células restantes se utilizaron para la extracción de ADN utilizando la técnica de fenol-cloroformo. El segmento específico del gen ccr5 fue amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores: CCR5-Delta1 (5′-ACCAGATCTCAAAAAGAAGGT CT-3′) y CCR5-Delta-2 (5′-CATGATGGTGAAG ATAAGCCTCACA-3′). La reacción contenía 5 pmol de cada imprimación, 0,3 unidades de Taq ADN polimerasa (Perkin-Elmer), 2 mM de MgCl2 y 200 µM de cada dNTP en un volumen final de 25 µl., La reacción fue sometida a 30 ciclos de amplificación con tres temperaturas 96 ° C x 15 seg, 58°C x 60 seg y 72°C x 60 seg. el resultado de la amplificación fue electroforizado en un gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo transiluminación U. V. Para el genotipo salvaje (ccr5 / CCR5) el producto PCR fue de 225 PB mientras que un producto de 193 PB indicó un mutante homocigoto (Delta-32/Delta-32). La presencia de ambas bandas indica un genotipo heterocigoto (CCR5 / Delta-32) (figura).,

análisis estadístico-se compararon las frecuencias alélicas y genotípicas encontradas y se evaluaron las diferencias mediante el test de chi cuadrado (chi2). Las diferencias entre las frecuencias esperadas y observadas de genotipos fueron evaluadas por la misma prueba.