la croissance et le maintien de microbes sur des milieux contenant de la gélose dans des boîtes de Pétri sont depuis longtemps une pratique courante en microbiologie. Traditionnellement, la méthode préférée pour l’analyse quantitative des populations de cultures pures et mixtes repose sur le placage de dilutions en série et le comptage ultérieur des unités formant des colonies (UFC)., Au cours des dernières années, une gamme de méthodes alternatives, à haut débit (HT), reposant sur la PCR quantitative (Neeley et al. 2005; Haarman et Knol 2006), étiquetage fluorescent (Blasco et al. 2003; Lay et coll. 2005) ou le sondage du génome avec des micro-réseaux (Bae et al. 2005) ont gagné en popularité (Liu et coll. 2004a). Cependant, la plupart de ces méthodes mesurent différentes entités, c’est-à-dire toutes les cellules, y compris les cellules non viables. De plus, ces méthodes peuvent nécessiter l’utilisation d’équipements spéciaux ou le développement de protocoles étendus., De plus, certaines de ces méthodes sont peu compatibles avec des substrats complexes et des échantillons environnementaux. Cela explique en grande partie pourquoi le dénombrement des microbes par comptage des colonies est encore une méthodologie largement appliquée. Actuellement, la microbiologie s’oriente de plus en plus vers les analyses HT, ce qui peut nécessiter l’utilisation de grandes quantités de plaques. Il en résulte de sérieux inconvénients lors de l’utilisation de techniques conventionnelles de placage et de comptage de colonies. La préparation des milieux et des plaques ainsi que le comptage des colonies prennent beaucoup de temps et de main‐d’œuvre., De plus, de grands volumes peuvent entraîner des coûts importants, en particulier lorsque des substrats indicateurs ou rapporteurs coûteux sont utilisés. Enfin, de nombreuses méthodes consomment de grandes quantités de matériaux, y compris des produits jetables, compromettant leur durabilité.
plusieurs rapports décrivent des technologies de placage alternatives dans lesquelles les volumes requis sont réduits (Jett et al. 1997; McNulty et Dunn 1999; Tornero et Dangl 2001; Hamilton et coll. 2002) ou le processus de comptage des colonies est automatisé (Marotz et al. 2001; Dahle et coll. 2004; Putman et coll. 2005)., Cependant, ces exemples nécessitent un équipement qui n’est pas présent dans les laboratoires de microbiologie standard (Gilchrist et al. 1973; Liu et coll. 2004b), ne peut entraîner qu’une réduction limitée de l’échelle (Gilchrist et al. 1973; Jett et coll. 1997; Hamilton et coll. 2002), ou sont mal adaptés à l’automatisation (McNulty et Dunn 1999; Hamilton et al. 2002). En s’appuyant sur ce travail, nous rapportons une méthode simple et flexible pour déterminer le nombre de cellules en capitalisant sur les formats de plaques de microtitres., Il intègre un placage miniaturisé rapide et un comptage (semi‐) automatisé des minicolonies permettant une réduction d’échelle de 100 fois le processus par rapport aux procédures de comptage CFU conventionnelles. Il peut être entièrement exploité avec un peu plus d’une pipette multicanal, un appareil photo numérique et ImageJ, un package de traitement d’image disponible en freeware (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Un certain nombre d’exemples sont présentés pour illustrer la puissance de l’approche pour l’évaluation rapide des dénombrements viables d’importants micro‐organismes industriels procaryotes et eucaryotes.,
pour le placage, Nous avons utilisé des dilutions en série 10 fois préparées dans des micro‐plaques de 96 puits à l’aide d’une pipette Genex Alpha à 12 canaux (Genex Labs, Torquay, Royaume‐Uni). Pour chaque dilution, des échantillons de cinq µl ont été pipetés sur une gélose contenant une plaque à l’aide de la même pipette. Typiquement, 60 à 120 gouttelettes ont été appliquées par Plaque carrée de 12 cm. Les plaques ont été séchées à l’air puis incubées jusqu’à ce que des colonies soient visibles avec une taille moyenne de 200-500 µm. Par la suite, ces minicolonies ont été photographiées avec un appareil photo numérique haute résolution Canon EOS 350D (Canon 0020X665; Canon Inc.,, Japon) équipé D’un objectif macro Sigma 105 mm (AF 105mm F2·8 ex MACRO F; Sigma Corporation, Japon). Les plaques ont été placées sur une surface noire et éclairées de côté afin d’obtenir un grand contraste entre les colonies et le fond.
Les images numériques ont été traitées dans ImageJ à l’aide d’un nouveau plug‐in qui peut être téléchargé comme Information de support. Le processus de comptage est représenté schématiquement sur la Fig. S1. Brièvement, les images en couleur ont été converties en niveaux de gris 8 bits et inversées., Par intervention manuelle en utilisant la fonction « seuil » D’ImageJ; les colonies ont été sélectionnées à partir de l’arrière-plan. Ensuite, toutes les images ont été empilées. Après inversion, la médiane a été prise de chaque pixel avec ses pixels voisins pour la réduction du bruit. La fonction « bassin versant » a été utilisée pour séparer les colonies fusionnées et la fonction « Analyser les particules » a été utilisée pour le comptage. La sortie a été enregistrée en tant que fichier texte et ensuite traitée dans Microsoft Excel.,
dans notre étude, nous avons spécifiquement visé à développer des protocoles de comptage rapide des UFC pour les microbes industriels, y compris les bactéries lactiques, Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae. Lorsque ces souches sont dénombrées par comptage conventionnel UFC, typiquement entre 30 et 300 colonies par boîte de Pétri gélose standard de 8 cm de diamètre se traduit par un comptage optimal. Un plus grand nombre peut facilement entraîner une sous-estimation, car les colonies individuelles ne peuvent être discriminées., Un faible nombre de colonies par plaque entraîne de grands écarts-types, ce qui est la racine carrée de la moyenne dans la distribution de Poisson. Cela implique que dans le cas où cinq colonies sont comptées, le nombre de cellules dans les échantillons plaqués est compris entre 1 et 9 avec une confiance de 95% alors que pour 100 cellules, ces valeurs sont de 80 et 120. Dans ce dernier cas, l’intervalle de confiance à 95% est de 20% d’écart par rapport à la moyenne. Nous avons donc cherché à développer un protocole qui permettrait le comptage d’au moins 100 colonies., Cela implique que, dans tout processus de réduction d’échelle du comptage des plaques, il est crucial d’augmenter le nombre de colonies pouvant être comptées par cm2 de surface de gélose. Dans nos expériences, cela a été réalisé en comptant les minicolonies d’une taille de 200-500 µm. Par conséquent, les colonies ont été comptées dès que les minicolonies sont visibles, ce qui est plus tôt que ce qui est normalement fait avec le comptage conventionnel. De plus, la croissance de nombreuses colonies sur une surface relativement petite entraîne des colonies plus petites, par exemple en raison de la disponibilité limitée du substrat (Liu et al. 2004b)., Cela augmente efficacement le nombre de colonies qui peuvent être comptées par cm2 de surface de gélose.
Nous avons utilisé les procédures décrites ci‐dessus pour effectuer un comptage viable de divers micro‐organismes industriels et nous avons comparé ces données aux procédures de comptage conventionnelles. Par conséquent, Streptococcus thermophilus CNRZ1066, Lactococcus lactis MG1363, Lact. plantarum WCFS1, E. coli DH5a et S. cerevisiae CBS57957 ont été mis en culture dans des milieux appropriés (Tableau 1) pendant environ 24 h à 37°C. des dilutions de Culture ont été préparées dans des plaques de 96 puits en 12 fois et celles‐ci ont été plaquées à l’aide des deux méthodes., Pour la méthode conventionnelle, 50 échantillons de µl ont été pipetés sur une plaque de gélose ronde de 8 cm de diamètre avec un pipetman P100 Gilson et étalés à l’aide d’un tampon de verre. Les dénombrements moyens D’UFC étaient comparables et les écarts-types comparables ou inférieurs à la méthode de minicolonie confirmant la pertinence de la méthode pour un comptage rapide D’UFC. À partir des écarts-types du tableau 1, on peut conclure que la sensibilité de la méthode rapide est comparable à la méthode conventionnelle, bien que la variation entre les nombres puisse différer selon le type de pipettes utilisées, comme l’ont fait valoir Jett et coll., (1997).
Par exemple, Lact. les taches plantaires contenant des minicolonies avaient un diamètre d’environ 9 mm et il est donc possible de compter jusqu’à 200 colonies par cm2 efficacement sur gélose MRS‐galactose, ce qui est généralement un à deux ordres de grandeur plus élevé qu’avec un placage conventionnel. Nous avons constaté que la taille des taches et des minicolonies peut varier en fonction du type de milieu de gélose, du temps de séchage, de la matrice de l’échantillon et des espèces d’intérêt (non représentées)., Elle peut avoir une incidence sur le nombre de colonies pouvant être dénombrées par tache de 5 µl, généralement entre 10 et 150, mais pas sur le nombre de colonies pouvant être dénombrées par cm2 pour cette espèce. La limite de détection de la minicolony méthode est similaire à celle de la méthode conventionnelle. La gamme dynamique de la nouvelle méthode a été trouvée égale à la méthode conventionnelle (données non présentées).
ces dernières années, des alternatives et des variantes de HT ont été développées pour de nombreuses techniques microbiologiques conventionnelles., Les meilleurs exemples sont probablement les cultures par lots liquides pour lesquelles diverses alternatives multi-puits appartiennent maintenant à l’équipement de laboratoire standard. De plus, plusieurs solutions de rechange pour le comptage de L’UFC sont rapportées (Dahle et al. 2004; Liu et coll. 2004b; Putman et coll. 2005). Les débits sont augmentés en se concentrant soit sur l’automatisation du processus de comptage, soit sur la miniaturisation du placage lui-même., La nouveauté de la méthode présentée ici repose sur l’intégration de ces aspects alors qu’elle ne nécessite que du matériel de laboratoire standard, un appareil photo numérique, un logiciel d’imagerie disponible en tant que Logiciel gratuit et un plug‐in dédié disponible en tant que matériel supplémentaire au présent document. Le protocole de placage et de comptage rapide qui en résulte convient à une détermination rapide du nombre de cellules viables. La méthode est très flexible, car elle peut facilement être mise en œuvre pour différentes espèces microbiennes et elle est facile à utiliser., Grâce à sa miniaturisation, il réduit la quantité de matériaux nécessaires d’environ 100 fois, ce qui en fait une alternative économique et efficace pour les méthodes conventionnelles. Étant donné que le comptage est partiellement automatisé, l’utilisateur peut surveiller les étapes critiques de l’acquisition et du traitement des données sans la variabilité rencontrée par le comptage manuel des UFC (Lumley et al. 1997). Nous prévoyons que ce protocole est un outil précieux pour l’énumération de routine des microbes industriels dans les laboratoires de recherche et de contrôle de la qualité.
