Francisco J Diaz, Jorge Vega, Paul J Patiño*, Gabriel Bedoya,
Jorge Nagles**, Cecilia Villegas**, Rodrigo Vesga***, Maria T Rugeles/+

Laboratoire de virologie *Laboratoire D’Immunologie, Département de microbiologie et parasitologie, Faculté de Médecine, Universidad de Antioquia, AA 1226, Medellin, Colombie **Institut de l’assurance sociale, Medellin, Colombie ***Institut Metropolitan Health, Medellin, Colombie

L’exposition répétée au virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) n’entraîne pas toujours une séroconversion., Les Modifications des corécepteurs pour l’entrée du VIH dans les cellules cibles sont l’un des facteurs qui bloquent l’infection. Nous avons étudié la fréquence de la mutation Delta-32 dans le gène ccr5 à Medellin, en Colombie. Deux cent dix-huit individus répartis dans trois groupes différents ont été analysés pour la mutation Delta-32 dans le gène ccr5 par réaction en chaîne par polymérase (PCR): 29 séropositifs du VIH (SP), 39 séronégatifs exposés (ESN) et 150 individus en tant qu’échantillon de population générale (GPS). La fréquence de L’allèle mutant Delta-32 était de 3,8% pour ESN, 2,7% pour GPS et 1,7% pour SP., Un seul génotype Mutant homozygote (Delta-32 / Delta-32) a été trouvé parmi les NSE (2,6%). Le génotype hétérozygote (ccr5 / Delta-32) a été trouvé dans huit GPS (5,3%), dans un SP (3,4%) et dans un ESN (2,6%). Les différences dans les Fréquences alléliques et génotypiques entre les trois groupes n’étaient pas statistiquement significatives. Une comparaison entre les fréquences génotypiques attendues et observées a montré que ces fréquences étaient significativement différentes pour le groupe ESN, ce qui suggère indirectement un effet protecteur du génotype mutant (Delta-32/Delta-32)., Étant donné que ce génotype mutant explique la résistance de l’infection chez une seule de nos personnes ESN, différents mécanismes de protection doivent jouer un rôle plus important dans cette population.,

mots clés: mutation CCR5 – Delta-32 – infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) – séronégatif exposé

depuis le début de l’épidémie du syndrome d’immunodéficience acquise (sida), il a été déterminé que l’activité sexuelle avec plusieurs partenaires était le principal facteur de risque d’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) avec le développement ultérieur du sida., Cependant, il existe de solides preuves suggérant une résistance naturelle à l’infection chez plusieurs personnes qui sont restées non infectées malgré le fait qu’elles ont eu plusieurs expositions au VIH, en particulier lors de rapports sexuels (Paxton et al. 1996). La base biologique de cette résistance commence tout juste à être comprise.

pour pénétrer dans la cellule cible, le VIH nécessite la présence de la molécule CD4 qui agit comme récepteur et d’une seconde molécule ou corécepteur, qui dans la majorité des cas est un récepteur de chimiokine (Deng et al. 1996, Feng et coll. 1996)., Parmi les récepteurs de la chimiokine, CCR5 et CXCR4 sont les principaux corécepteurs de l’entrée du VIH.

presque simultanément à la découverte des corécepteurs du VIH, une mutation du gène codifiant la molécule CCR5 a été décrite, ce qui confère un haut degré de résistance à l’infection par le VIH in vitro et in vivo (Paxton et al. 1996, Liu et coll. 1996). Cette mutation nommée Delta-32 consiste en une délétion de 32 paires de bases qui code pour une protéine non fonctionnelle, et par conséquent elle n’est pas exprimée dans la membrane cellulaire., Les individus homozygotes pour cette mutation ne présentent aucune altération immunologique ou biologique connue (Liu et al. 1996).

L’allèle Delta-32 est présent principalement dans la population caucasienne (Liu et al. 1996, Martinson et coll. 1997, Magierowska et coll. 1998). Aux États-Unis, la fréquence est de 8% à 10% dans la population blanche mais moins de 1% chez les individus Afro-Américains. Il existe également une très faible fréquence de la mutation chez les Caucasiens en Asie (Pakistan et Inde) et elle n’a pas été signalée en Chine, au Japon ou dans des populations africaines pures (Martinson et al. 1997)., En Amérique latine, les fréquences ont été à peine étudiées. Il n’a pas été détecté chez 32 individus du Venezuela ni dans des groupes amérindiens (Liu et al. 1996, Martinson et coll. 1997). En Colombie, aucun rapport ne traite de cette question.

chez les individus sexuellement exposés au VIH mais séronégatifs (ESN), la fréquence du génotype Delta-32/Delta-32 atteint 2,8% à 3,6%, ce qui correspond à deux à trois fois la fréquence observée dans la population caucasienne non exposée (Dean et al. 1996, Huang et coll. 1996)., Cette fréquence peut aller jusqu’à 33% chez les personnes à haut risque d’infection (Huang et coll. 1996). En revanche, les personnes infectées par le VIH présentent la plus faible fréquence D’allèle Delta-32. Il a été considéré que les individus ayant un génotype Mutant homozygote (Delta-32 / Delta-32) étaient résistants à 100% à l’infection par le VIH, au moins avec des souches M-tropiques, qui utilisent la molécule CCR5 comme corécepteur. Cependant, récemment, il y a eu des rapports d’infection à VIH chez deux personnes homozygotes pour l’allèle mutant (Delta-32/Delta-32) (Biti et al. 1997)., Ces infections pourraient avoir eu lieu avec des souches T-tropiques qui utilisent la molécule CXCR4 comme corécepteur pour pénétrer dans les cellules cibles.

Il a été difficile d’établir si le génotype ccr5/Delta-32 confère un degré de résistance à l’infection. Les études sur cet aspect sont contradictoires (Samson et al. 1996, Dean et coll. 1996, Huang et coll. 1996, Hoffman et coll. 1997).,

de la littérature, on peut conclure que le génotype Delta-32/Delta-32 confère un haut degré de protection à l’infection par le VIH, mais ce n’est pas le principal facteur associé à la résistance, car la majorité des ESN ne possèdent pas ce facteur génétique. Différents mécanismes tels que d’autres mutations coréceptrices ou facteurs immunologiques pourraient expliquer l’absence d’infections dans ce groupe à haut risque.,

cette étude a été réalisée pour estimer la fréquence de L’allèle Delta-32 et les génotypes du gène ccr5 dans différents sous-groupes: ESN, séropositif et population générale afin d’explorer l’influence de ce facteur génétique dans le comportement de l’infection par le VIH dans notre pays.,

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

MATERIALS AND METHODS

Population -The study was carried out in three groups of individuals., NSE: personnes ayant des antécédents de rapports sexuels répétés sans protection avec des sujets infectés par le VIH. Le nombre de sujets dans ce groupe est proche de l’univers des ESN connus dans notre ville; SP: toutes les personnes incluses dans ce groupe étaient des partenaires sexuels D’ESN qui avaient des anticorps anti-VIH et certaines d’entre elles présentaient également des signes cliniques d’infection par le VIH; GPS: cette population était des volontaires adultes, la plupart d’entre eux des étudiants et des travailleurs de notre établissement ou des établissements de santé liés à notre université. Aucun d’entre eux n’a été sélectionné en fonction du risque d’infection par le VIH., Le statut sérologique du VIH pour les personnes de ce groupe n’a pas été déterminé.

statut sérologique – le statut sérologique des individus du groupe ESN a été confirmé par un test ELISA (Enzygnost HIV-1+2 Plus, Behring Diagnostics, Margurg, Allemagne).

détermination du génotype – la détermination du génotype a été effectuée comme décrit précédemment (Michael et al. 1997). Brièvement, un échantillon de sang périphérique a été prélevé avec de l’EDTA comme anticoagulant. Les cellules mononucléées ont été séparées par un gradient Ficoll-Hypaque., Une partie des cellules a été cryoconservée pour de futures études fonctionnelles. Les cellules restantes ont été utilisées pour l’extraction de L’ADN en utilisant la technique phénol-chloroforme. Le segment spécifique du gène ccr5 a été amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant les amorces suivantes: CCR5-Delta1 (5′-ACCAGATCTCAAAAGAAGT CT-3′) et CCR5-Delta-2 (5′-CATGATGGTGAAG ATAAGCCTCACA-3′). La réaction contenait 5 pmol de chaque amorce, 0,3 unité D’ADN polymérase Taq (Perkin-Elmer), 2 mM de MgCl2 et 200 µM de chaque dNTP dans un volume final de 25 µl., La réaction a été soumise à 30 cycles d’amplification avec trois températures de 96 ° C x 15 sec, 58 ° C x 60 sec et 72 ° C x 60 sec. le résultat de l’amplification a été électrophorésé dans un gel d’agarose à 2%, coloré avec du bromure d’éthidium et visualisé sous transillumination U. V. Pour le génotype sauvage (ccr5 / ccr5), le produit PCR était de 225 PB tandis qu’un produit de 193 PB indiquait un mutant homozygote (Delta-32/Delta-32). La présence des deux bandes indique un génotype hétérozygote (ccr5/Delta-32) (Figure).,

analyse statistique-les Fréquences alléliques et génotypiques trouvées ont été comparées et les différences évaluées à l’aide du test du chi carré (chi2). Les différences entre les fréquences attendues et observées des génotypes ont été évaluées par le même test.

RÉSULTATS

Nous avons étudié 218 individus divisés en trois groupes: ESN, le PS et le GPS. Leur répartition et leur profil démographique sont présentés au tableau I. tous les groupes avaient une moyenne d’âge similaire., Les groupes GPS et ESN avaient une distribution similaire du sexe, mais différente du Groupe SP dans lequel les hommes étaient prédominants. La majorité des couples étaient hétérosexuels et peu d  » entre eux étaient homosexuels ou des personnes non-pared avec des préférences bisexuelles. Tous les sujets séropositifs avaient contracté l’infection par des rapports sexuels.

les fréquences de génotype sont indiquées dans le tableau II. la fréquence la plus élevée était pour le génotype sauvage (ccr5+/ccr5). Le génotype hétérozygote (ccr5 + / Delta-32) a été trouvé dans huit GPS, dans un SP et dans un ESN., Un seul génotype Mutant homozygote (Delta-32 / Delta-32) a été trouvé parmi L’ESN (Figure). La différence de fréquences entre les trois groupes étudiés n’était pas statistiquement significative. Les Fréquences alléliques pour ccr5 et Delta-32 sont indiquées dans le tableau III. La fréquence de L’allèle mutant Delta-32 était de 3,8% pour ESN, 2,7% pour GPS et 1,7% pour SP. Les différences n’étaient pas statistiquement significatives.

sur la base des Fréquences alléliques de chaque groupe, il est possible de prédire la fréquence du génotype en considérant qu’ils suivent l’équilibre de Hardy-Weinberg., Cela signifie que les fréquences ont une distribution binomiale selon l’équation suivante: p2 + 2pq + q2 = 1, où p et q sont les fréquences alléliques de ccr5+ et Delta-32, respectivement, et p2, 2pq et q2 sont les fréquences des génotypes de ccr5+/ccr5+, ccr5+/Delta-32 y Delta-32/Delta-32, respectivement. Une comparaison entre les fréquences génotypiques attendues et observées est présentée dans le tableau IV., Dans SP et GPS, les fréquences observées sont similaires à celles attendues, tandis que dans le groupe ESN, la fréquence observée diffère significativement de la fréquence attendue s’éloignant de L’équilibre de Hardy-Weinberg (p<0,0005).

étant donné que le nombre d’individus dans le groupe ESN et la fréquence de Delta-32 étaient faibles, il n’a pas été possible d’établir une relation entre le génotype ccr5 et certains comportements à risque tels que la fréquence d’utilisation du préservatif, le type de relation sexuelle et le temps d’exposition., La seule personne avec un génotype homozygote mutant était une femme qui avait une relation sexuelle stable pendant trois ans avec une moyenne de huit rapports sexuels non protégés par mois avec son mari infecté. Le sujet avec le génotype hétérozygote trouvé dans ce groupe correspond à un homme bisexuel promiscuité qui avait fréquemment des rapports sexuels anaux pendant sept mois avec un couple infecté.,

DISCUSSION

La composition ethnique de la population Colombienne est un produit du mélange d’Européens, d’Africains et d’Indiens. La contribution de l’Europe est principalement espagnole (Bravo et al. 1996). Deux rapports de fréquence Delta-32 dans la population espagnole ont montré une fréquence d’allèle de 8,6% (IC 95% 4,9-12,3%) chez les Basques, 8,2% (IC 95% 5,4-10,9%) chez les Catalans et 5% (IC 95% 2,0-8,0%) chez les individus de San Sebastian (Martinson et al. 1997, Magierowska et coll. 1998).,

dans notre étude, la fréquence de Delta-32 pour le groupe GPS était de 2,7% (IC à 95% 0,90 – 4,5%). Sur la base de ce résultat, nous pourrions calculer que la composante espagnole du GPS est proche ou même inférieure à 50%. Cette estimation est différente d’un rapport précédent de Bravo et coll. (1996), dans lequel, à l’aide d’un panel de différents marqueurs génétiques, ils ont observé une prévalence de la composante européenne par rapport aux autres races de la population de notre province (Antioquia)., Étant donné que l’échantillon GPS comprenait non seulement des personnes nées à Antioquia mais des résidents de cette province, il est possible qu’un nombre important d’individus inclus dans ce groupe soient nés dans différentes provinces où l’influence de la race européenne n’est pas connue. Ce fait pourrait expliquer la faible prévalence observée de Delta-32.

bien que cette étude ait révélé une prévalence plus élevée de l’allèle Delta-32 et du génotype Delta-32/Delta-32 parmi les NSE, les différences dans les fréquences n’étaient pas significatives (tableaux II, III)., La taille réduite de l’échantillon n’a probablement pas permis de montrer une association significative entre le génotype et l’infection.

en l’absence de sélection positive et négative ou d’autres facteurs tels qu’une migration récente fréquente, un taux de mutation élevé ou un indice d’endogamie élevé, la distribution des génotypes dans chaque groupe doit être similaire aux valeurs prédites suivant la distribution de Hardy-Weinberg. Le GPS présentait une distribution génotypique en équilibre., Puisque la circulation du VIH est un facteur de sélection, ce fait pourrait avoir deux explications: la fréquence du génotype Protecteur Delta-32/Delta-32 est trop faible pour être perceptible, ou le degré d’exposition au VIH est encore faible dans cette population. Connaissant la fréquence de L’allèle Delta-32, nous avons calculé la fréquence du génotype Delta-32/Delta-32 à 0,00071. Cela signifie qu’une seule personne parmi 1406 individus porterait le génotype homozygote mutant (Delta-32/Delta-32).

la distribution des génotypes dans SP est également selon L’équilibre de Hardy-Weinberg., L’explication de ce fait dans ce groupe est plus difficile, car tous les individus ont été sexuellement exposés au VIH et cela doit avoir sélectionné positivement le génotype sauvage ccr5 + / ccr5+. Il est possible que l’évolution rapide vers le sida et la mort d’individus porteurs de génotypes sauvages sur l’hétérozygote puissent compenser cet effet, mais encore une fois la faible fréquence de L’allèle Delta-32 rend l’analyse difficile.,

le manque d’équilibre dans les fréquences génotypiques chez L’ESN était très significatif en raison de la présence d’un individu avec le génotype Delta-32/Delta-32. Cela rend la fréquence 17 fois supérieure à celle prévue (Tableau IV). Cette constatation ne s’explique guère par l’un des arguments suivants qui peuvent également contribuer à briser L’équilibre Hardy-Weinberg dans une population: l’immigration européenne récente et l’endogamie, car ces faits ne sont pas fréquemment trouvés parmi notre population. Le taux de mutation de cette mutation ne devrait pas non plus être élevé., La possibilité que cette distribution ait pu se produire de manière aléatoire est également très faible (p<0.0005). La sélection positive d’individus avec un tel génotype Delta-32/Delta-32 parmi les NSE est l’explication la plus plausible du manque d’équilibre. Par conséquent, l’effet protecteur de ce génotype a été montré, bien qu’indirectement.

dans notre étude, la fréquence du génotype Delta-32/Delta-32 n’explique la résistance à l’infection que chez un très faible pourcentage D’individus ESN (2,6%)., Cela concorde avec d’autres études qui ont montré des résultats similaires (Bernard et al. 1999). Étant donné que de nombreuses personnes du groupe ESN ont eu un degré élevé d’exposition au VIH, il doit y avoir d’autres mécanismes responsables de cette « protection naturelle ». Récemment, il a été démontré que le VIH pouvait utiliser d’autres récepteurs de la chimiokine tels que CCR2 et CCR3 comme correcteurs (Berger et al. 1999). Par conséquent, des mutations dans ces molécules ou dans les ligands des récepteurs de la chimiokine pourraient expliquer la résistance à l’infection par le VIH de certains individus., Cependant, la mutation CCR2-64I, n’a pas été associée à un phénotype résistant, mais plutôt à un retard dans la progression de la maladie (Smith et al. 1997). De même, le polimorphisme SDF-1-3’a rapporté dans l’alpha-chimiokine SDF – 1 était associé au retard dans l’apparition des symptômes liés au sida (Winkler et al. 1998). D’autres gènes du système immunitaire tels que ceux du système HLA semblent également influencer la progression de la maladie, bien que les effets soient complexes et puissent dépendre d’interactions avec d’autres gènes de l’hôte (McNicholl et al. 1997)., Des réponses immunitaires cellulaires spécifiques, en particulier médiées par des lymphocytes T cytotoxiques ou des réponses humorales au niveau de la muqueuse ont été démontrées chez des individus séronégatifs exposés (Mazzoli et al. 1997), indiquant que l’immunité acquise pourrait être le mécanisme responsable du contrôle de l’infection chez ces personnes. L’importance relative de ces mécanismes dans les populations avec les différents modes d’exposition ou de fond génétique doivent être clarifiés

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Fig. | Table | Tableau II Tableau III Tableau IV

Ce travail a reçu le soutien financier de l’Université d’Antioquia et de Banco de la Republica.

+auteur Correspondant. Télécopie: + 57-4 510 6062. Courriel: [email protected].,co

Received 26 August 1999

Accepted 4 January 2000