Développement des essais: 5 considérations et 8 principes fondamentaux

la capacité de concevoir, de construire et d’exécuter des essais spécifiques, sensibles et robustes est cruciale dans tous les domaines de la recherche biomédicale. À titre d’exemple, dans les applications de recherche fondamentale, il peut être nécessaire de quantifier les niveaux cellulaires d’une protéine particulière, de déterminer les niveaux d’un métabolite dans le sérum ou l’urine ou, peut-être, de comparer l’activité catalytique d’une enzyme dans les tissus normaux et malades ., Dans les industries pharmaceutiques et biotechnologiques, des tests sont nécessaires pour identifier et caractériser de nouvelles molécules médicamenteuses potentielles . D’autres études peuvent nécessiter la mesure quantitative des niveaux d’expression génique .

indépendamment de l’application spécifique ou de la molécule particulière à mesurer, un certain nombre de facteurs fondamentaux doivent être pris en compte lors de l’élaboration d’un dosage biologique., Il est important qu’une attention particulière soit accordée non seulement au test lui-même, mais également à l’ensemble du flux de travail qui doit être développé, de la préparation des échantillons à l’analyse de la qualité des données fournies par le test. Les principaux aspects de la mise au point des essais examinés dans cet article sont d’application générale. Ils sont valables quel que soit le type de test à mettre au point (p. ex.,, tests à base d’anticorps tels que ELISA et électrochimiluminescence, détermination de la concentration totale de protéines / protéines, tests d’activité enzymatique, tests à base de cellules ou PCR quantitative, ou test spécialisé tel que le test d’activation d’une seule molécule ). De même, les aspects clés sont valables quel que soit le système de détection utilisé, qu’il soit basé sur l’absorbance, la fluorescence, la radioactivité ou même la spectrométrie de masse., Chaque test spécifique aura ses propres particularités, mais en prêtant une attention particulière aux points discutés ci-dessous, le chercheur peut aider à s’assurer qu’ils développent un test robuste, fiable et adapté à l’usage. Souvent, des lignes directrices et/ou des discussions approfondies sur le développement de tests utilisant des technologies spécifiques existent, telles que celles pour les mesures ciblées de peptides spectrométrie de masse . Bien que l’accent soit mis sur les questions particulières des analyses ciblées de la SEP, un certain nombre de points de discussion sont pertinents pour tout projet de développement de tests., En particulier, Les auteurs insistent sur la nécessité d’adopter une approche adaptée à l’Objectif du développement et de la validation des essais . Les tests cellulaires complexes qui visent à imiter l’environnement cellulaire in vivo jouent un rôle croissant dans la découverte et le développement de médicaments. Bien que les détails spécifiques de ces essais dépassent le cadre de cet article, il est important de souligner que les principes de base du développement des essais doivent être respectés afin de construire des essais robustes et fiables qui génèrent des données significatives .,

des trousses de développement D’essais commerciaux sont disponibles pour faciliter l’établissement des essais. Par exemple, Stadtmauer EA et al ont utilisé le kit de réactifs auxiliaires DuoSet de R&d Systems pour établir un test ELISA détectant la protéine Cas9 résiduelle dans les cellules T conçues par CRISPR . Les organisations commerciales ont mis au point un large éventail de tests et devraient d’abord être explorées avant d’entreprendre l’effort de développer un nouveau test. Les tests d’échantillons comprennent le test D’angiogenèse magnétique à base de billes de MILLIPLEX MAP chez la souris à partir de MilliporeSigma .,

lors d’un projet de développement d’un test, le chercheur doit poser un certain nombre de questions afin de définir les exigences exactes du test.

le point de départ est d’être absolument clair quant à quelle molécule et précisément quelle propriété de cette molécule doit être mesurée. Cela peut sembler évident, mais il s’agit d’une question d’importance fondamentale qui sous-tend toutes les activités ultérieures de développement d’essais. Par exemple, le chercheur souhaite-t-il mesurer la quantité totale d’une protéine particulière dans un lysat cellulaire ou seulement la forme phosphorylée, ou à la fois la protéine totale et la protéine phosphorylée ?, De même, l’étude peut dicter que des isoformes spécifiques ou des variantes d’épissure de la protéine d’intérêt doivent être mesurées . Dans le cas d’une protéine, il faut savoir clairement si le paramètre clé à mesurer est la quantité de protéine présente ou sa fonction biologique, telle que l’activité enzymatique ou l’effet d’une cytokine sur des cibles cellulaires potentielles. Alternativement, il peut être acceptable ou souhaitable de mesurer le niveau d’expression des gènes au niveau de l’arnm., Il se peut que l’étude dicte que des tests distincts soient développés pour mesurer l’expression des gènes, les niveaux de protéines à l’état d’équilibre et la fonction biologique, respectivement ; chaque test générera des informations différentes mais complémentaires sur la molécule d’intérêt.

Il est important de prendre en considération la source de la molécule à doser. La molécule doit-elle être mesurée dans un liquide corporel, tel que le sérum ou l’urine? La molécule doit-elle être mesurée dans un organe obtenu à partir d’un animal expérimental ou dans un échantillon de biopsie d’un patient?, Peut-être que le matériel source sera du tissu post-mortem. Il se peut que la source soit des cellules cultivées in vitro, auquel cas une considération importante est de savoir si ce seront des cellules primaires rares ou une lignée cellulaire immortalisée facilement évolutive.

la source de la molécule déterminera la quantité et la disponibilité de l’échantillon. Il déterminera également la concentration de la molécule d’intérêt et peut influencer profondément sa stabilité, comme discuté dans les sections suivantes., Ainsi, la source de la molécule d’intérêt est susceptible d’avoir une influence significative sur le flux de travail global du test qui est finalement développé.

Il est également important de comprendre la stabilité de la molécule pour laquelle le test doit être développé. Est-il relativement stable ou est-il extrêmement instable, nécessitant des précautions particulières à prendre lors de la collecte et de la préparation de l’échantillon pour analyse afin d’obtenir des données d’analyse significatives?, Même les molécules stables dans la forme isolée peuvent être instables dans le milieu biologique complexe des échantillons à analyser où elles peuvent être sujettes à l’oxydation, à la protéolyse ou à la perte de modifications post-traductionnelles. Il peut, par exemple, être nécessaire d’inclure des agents réducteurs ou des inhibiteurs de protéase et/ou de phosphatase dans des tampons d’échantillons pour maintenir les molécules sous leurs formes physiologiquement pertinentes à la fois pendant la préparation de l’échantillon et au cours de l’essai lui-même., La source de la molécule est une considération importante ici; une molécule qui est stable dans, disons, le sérum peut s’avérer extrêmement instable dans un homogénat de foie. Si vous testez une biopsie ou un tissu post-mortem, il est important de savoir comment le tissu a été manipulé et stocké, car cela peut affecter profondément la quantité et la qualité de certaines molécules.,

afin de mettre au point un dosage adapté à l’usage, il est important de décider dès le départ si une mesure semi-quantitative de la molécule, comme le Western blot, répond aux exigences du projet ou si un dosage rigoureusement quantitatif est nécessaire.

Il est également important de considérer le nombre d’échantillons doivent être analysés. Si seulement une poignée d’échantillons sont analysés, un format d’analyse manuelle en plusieurs étapes à forte intensité de main-d’œuvre peut être parfaitement acceptable., Inversement, si des milliers ou des dizaines de milliers de tests doivent être exécutés, peut-être dans le cadre d’un exercice de profilage de composés, il sera important de simplifier, de rationaliser et d’automatiser le processus de test autant que les ressources de laboratoire le permettent, avec, par exemple, un format comme les puces à puces. Cependant, les tableaux apportent leur propre ensemble de problèmes, tels que la variation spatiale intra-test .,

les réponses à toutes ces questions concernant la molécule à analyser joueront un rôle clé pour aider le chercheur à décider du format le plus approprié pour ses besoins particuliers, et il convient de garder à l’esprit lors de l’examen des principes fondamentaux du dosage discutés dans la section suivante.

Après avoir examiné ces questions concernant la molécule à analyser, une attention particulière doit être portée à un certain nombre de questions techniques / pratiques fondamentales qui s’appliquent indépendamment de la molécule d’intérêt particulière ou du format d’analyse spécifique adopté.,

absolument essentiel est la spécificité du test. Après avoir décidé exactement quelle molécule et paramètre de cette molécule doit être mesurée, le chercheur doit établir que le test ne mesurera que ce qu’il veut mesurer et pas autre chose., S’il s’avère que le test mesure à la fois la molécule souhaitée et d’autres molécules, il est possible que des mesures soient prises pour améliorer la spécificité du test.

deux aspects qui se chevauchent de la spécificité du dosage doivent être pris en compte.

• Premièrement, les réactifs de détection primaires sont-ils suffisamment spécifiques? Par exemple, dans le cas du test basé sur la CLHP, le chercheur est-il convaincu qu’un pic identifié à un moment de rétention particulier est la molécule d’intérêt et non une molécule différente qui vient de co-éluer avec la molécule d’intérêt., Ici, la source de l’analyte doit être envisagée. L’analyse des échantillons d’urine ne peut donner lieu à des pics de co-élution avec la molécule d’intérêt. Cependant, il peut ne pas en être de même pour les échantillons d’homogénat sérique ou tissulaire analysés dans le même dosage. Dans un test à base d’anticorps, l’anticorps utilisé est-il absolument spécifique pour la protéine cible ou réagit-il également avec d’autres protéines?, Il est possible d’obtenir des anticorps qui sont spécifiques pour une protéine particulière ou une modification post-traductionnelle particulière, telle que la phosphorylation à un site spécifique ou à un néo-épitope généré lors du clivage par une protéinase . Très souvent, un anticorps avec une affinité plus élevée est souhaité . De tels réactifs d’anticorps doivent être caractérisés rigoureusement dans les conditions d’analyse réelles pour s’assurer qu’ils ont la spécificité souhaitée, réagissant uniquement avec le produit souhaité et non avec la molécule substrat/précurseur., Dans les tests qui n’utilisent pas la détection d’anticorps, tels qu’un test de clivage peptidique fluorogène, le degré de spécificité sera beaucoup plus faible. Au lieu de clivage à un site spécifique générant un signal, clivage à un site quelconque dans le peptide va maintenant donner lieu à un signal.
• cela nous amène au deuxième aspect de la spécificité du dosage et constitue un problème particulier pour les tests enzymatiques in vitro., Même si les réactifs de détection sont spécifiques à un événement particulier que l’on souhaite analyser, il se peut que, dans un lysat cellulaire brut ou un homogénat tissulaire, plusieurs enzymes soient capables d’effectuer ce même événement (par exemple, phosphorylation, clivage protéolytique ou autre modification post-traductionnelle). Ce problème sera encore plus grand pour l’exemple d’analyse de clivage de peptide fluorogénique donné ci-dessus., Le problème des multiples activités de chevauchement dans les lysats bruts peut souvent être surmonté par l’inclusion d’une étape supplémentaire de préparation d’échantillon, telle qu’une immuno-précipitation spécifique, afin d’obtenir la spécificité de dosage souhaitée . Alternativement, selon la nature de l’étude, la meilleure solution peut être d’exécuter le test d’activité en utilisant une enzyme hautement purifiée (native ou recombinante).

quel est la sensibilité de l’essai doivent être? Ce sera déterminée à la fois par les niveaux de la molécule d’intérêt dans l’échantillon et le volume de l’échantillon disponible., Le point important est que le test doit être suffisamment sensible pour que le niveau de la molécule se situe bien dans la plage dynamique du test (voir ci-dessous). Il s’agit d’une considération importante au moment de décider du format d’analyse et du système de détection. Si une grande sensibilité est requise, alors une fluorescence, plutôt qu’une absorbance, la lecture est plus susceptible de donner la sensibilité souhaitée. La sensibilité peut également être augmentée en utilisant l’amplification enzymatique du signal original ., De tels systèmes d’analyse « couplés » peuvent être extrêmement sensibles, mais offrent également une possibilité accrue pour l’échantillon d’analyse d’interférer avec le test (voir ci-dessous).

Il est important de déterminer l’étendue de la dynamique de l’essai. En d’autres termes la plage sur laquelle le test de lecture est proportionnelle à la quantité de molécule cible dans l’échantillon analysé., Dans le cas d’un test pour mesurer la concentration d’une molécule, il est important que le test (quel que soit le format adopté est bien calibré par la construction d’une courbe d’étalonnage comme l’exemple hypothétique dans la Figure 1. De même, dans le cas d’un dosage enzymatique, il faut s’assurer que le dosage fonctionne dans une plage telle que la vitesse initiale de la réaction soit mesurée et que la vitesse mesurée soit proportionnelle à la quantité d’enzyme ajoutée au dosage., Afin de rester dans la plage dynamique de l’analyse (certains) échantillons peuvent avoir besoin d’être dilués ou concentrés. Cela peut être un problème particulier si la molécule d’intérêt est présente à des niveaux très différents dans différents échantillons. Ne pas rester dans la plage dynamique de l’essai entraînera la génération de données fausses. Les plages dynamiques doivent également être testées in vivo, si le test doit être utilisé in vivo , par exemple en utilisant des lignées cellulaires qui expriment une cible d’anticorps à différents niveaux pour le développement d’un test IHC .,

Figure 1. Calibrage de dosage / plage dynamique.

lors de la conception d’un test, il est important de prendre en compte les facteurs qui peuvent interférer avec la lecture du test conduisant à des résultats erronés. La question de la spécificité du dosage est discutée ci-dessus. Ici, nous discutons d’autres facteurs qui peuvent interférer avec la lecture du test.

dans le cas d’une lecture fluorescente, il est important de s’assurer que l’échantillon à doser n’éteint pas la lecture fluorescente., Cela peut être un problème particulier avec les dosages utilisant des lysats cellulaires bruts ou des homogénats tissulaires. De même, dans les essais enzymatiques ou cellulaires fluorogéniques utilisés à des fins de criblage/profilage de composés, le chercheur doit s’assurer, dans la mesure du possible, que les composés d’essai n’éteignent pas la lecture fluorescente. De tels composés présenteraient une activité inhibitrice apparente puissante tout en n’ayant aucun effet inhibiteur direct sur leur cible visée. Certains composés peuvent eux-mêmes fluorescents, donnant ainsi un faux signal de dosage., Une telle interférence composée peut être réduite en utilisant des reporters fluorescents qui excitent et émettent à des longueurs d’onde plus longues . Un autre problème commun est l’interférence par les composants de l’échantillon, tels que les agents réducteurs ou les détergents avec certains des tests de protéines populaires.

dans les essais à couplage enzymatique (qu’il s’agisse d’essais d’activité enzymatique ou de métabolites), il est essentiel de déterminer que les enzymes de couplage ne mesurent pas par inadvertance un composant de l’échantillon autre que la molécule d’intérêt., Si de tels tests sont utilisés pour le criblage ou la caractérisation de composés, il est important de s’assurer que le test est configuré de manière à mesurer l’inhibition de l’enzyme cible et non de la ou des enzymes de couplage . Si l’on soupçonne une interférence importante des composants de l’échantillon d’analyse, il faut envisager attentivement des étapes telles que les (immuno) précipitations ou la purification partielle afin d’éliminer ces composants . Le point clé est, quel que soit le format d’analyse adopté, d’être attentif aux sources potentielles d’interférence et aux moyens d’éliminer ou de minimiser leur impact sur l’analyse., Il ne faut pas présumer qu’un test mis au point pour mesurer une molécule dans un tissu, un type de cellule ou un fluide biologique donné sera acceptable lorsque le test sera effectué sur des échantillons provenant d’une source différente; le test devra être re-validé pour la nouvelle source d’échantillon.

afin de fiable, utilisable des données l’analyse doit être robuste et reproductible. Le test doit être robuste en ce sens qu’il n’est pas indûment affecté par des changements dans la préparation et la manipulation des échantillons., De même, il devrait donner les mêmes résultats quel que soit l’individu opérant le test. Le test doit être hautement reproductible (également appelé précision) de sorte que le degré de variation soit aussi faible que possible, tant sur une base intra qu’inter-test. Lors d’un seul essai, les répliques d’un échantillon standard et d’un échantillon « réel » devraient donner des valeurs très similaires, respectivement. De même, il devrait y avoir peu de variation quotidienne dans les valeurs de dosage obtenues.,

Si l’essai est de mesurer la quantité absolue (plutôt que relative) d’une molécule, alors il doit être étalonné (voir ci-dessus) par rapport à un étalon accepté afin de donner une quantification précise. Parfois, le flux de travail d’analyse nécessite un travail d’échantillonnage important (par exemple, concentration, élimination des composants d’échantillon interférents, etc..) afin que la molécule d’intérêt puisse être mesurée de manière fiable. Dans de tels cas, il est hautement souhaitable d’inclure une norme interne pour corriger les pertes d’analyte dans le flux de travail de l’analyse., Par exemple, dans le cas de MME tests, l’extrait à analyser peut être « enrichis » avec une quantité connue d’isotopes stables de la molécule d’intérêt. Pour un test HPLC, l’étalon interne pourrait être un composé structurellement lié à la molécule d’intérêt et qui n’est pas autrement présent dans l’échantillon d’essai. L’utilisation d’une norme interne est particulièrement importante si des données quantitatives très précises et précises sont requises .,

Les niveaux de robustesse, de reproductibilité et de précision acceptables dépendront du but de l’essai et devront être décidés par le chercheur pour leur propre utilisation actuelle.

En supposant une distribution gaussienne, deux résultats dont la moyenne diffère par > 2 écarts types (SD) sont considérés comme statistiquement significativement différents au niveau de confiance de 95%., Deux résultats de même divergence par > 3 SD sont considérés comme statistiquement significativement différents au niveau de confiance de 99,7%. Ainsi, plus la reproductibilité (précision) du test est grande, et donc plus la SD des lectures expérimentales est faible, plus le test sera discriminant.

Figure 2. Mesure de la performance du dosage.

les performances du test peuvent être analysées de différentes manières., Le rapport signal/arrière-plan ou fenêtre de signal (S / B = signal moyen/arrière-plan moyen) et le rapport signal / bruit (S / N = signal moyen-arrière-plan moyen / SD de l’arrière – plan) sont souvent utilisés comme mesures des performances du test. Cependant, ces ratios ne tiennent pas suffisamment compte de la variabilité du dosage. Un test statistique simple, la valeur Z’, a été développé qui fournit une mesure de la qualité du test qui tient compte à la fois de la fenêtre de signal et de la variabilité du test . Plus la valeur Z’ est élevée (Figure 2), plus le dosage est discriminant, avec un dosage parfait ayant un Z’ de 1., Pour un test de criblage à haut débit, une valeur Z ‘ De > 0,5 est généralement considérée comme acceptable. Bien que la statistique Z’ ait été initialement dérivée pour évaluer les tests HTS, elle est une mesure générale de la qualité des tests et peut être appliquée à n’importe quel test .

Les essais à haut débit utilisés dans la découverte de médicaments utilisent fréquemment des reporters fluorescents et luminescents pour permettre d’effectuer un grand nombre d’essais de manière automatisée., Cependant, avec le développement de nouvelles technologies, il y a un intérêt croissant pour l’utilisation de tests cellulaires sans étiquette qui utilisent des méthodes de détection biophysique . Un certain nombre d’instruments pour des essais sans étiquette sont maintenant disponibles dans le commerce . Il est important de noter que les essais sans étiquette évitent le risque d’artefacts causés par la présence du système de rapport. Par exemple , la luciférine de luciole, molécule Rapporteuse bioluminescente couramment utilisée, est elle-même un agoniste partiel du GPR35, ce qui complique potentiellement l’interprétation des données composés/pharmacologiques., Un autre avantage des tests sans étiquette est qu’ils permettent le criblage de composés contre les niveaux endogènes de récepteurs dans les cellules primaires et souches pertinentes pour la maladie .

des interactions rapporteurs-composés inattendues peuvent également se produire dans les tests biochimiques (en plus des problèmes de trempe et d’autofluorescence discutés ci-dessus). Par exemple, un certain nombre de composés qui activent L’activité protéique désacétylase de SIRT1 à l’aide d’un substrat peptidique marqué par TAMRA n’ont pas eu d’activité dans les essais enzymatiques utilisant une version non étiquetée du même peptide ou un substrat protéique natif sur toute la longueur., L’activation observée avec le substrat marqué TAMRA était un artefact dû à une interaction physique directe des composés avec le fluorophore TAMRA .

ainsi, lors de la conception et de la validation d’essais à des fins de criblage / profilage de composés, il est important de tenir compte du potentiel d’interactions composé-rapporteur. Les avantages potentiels de l’utilisation d’un test sans étiquette à un moment donné de la cascade de dépistage devraient être sérieusement pris en considération.