ensayo de Inmunoabsorción enzimática de cuarta generación para la detección simultánea de antígeno y anticuerpo del Virus de inmunodeficiencia humana

discusión

en este estudio, se evaluó el rendimiento del inmunoensayo DUO Ultra con muestras de orígenes diversos. Excluyendo los 74 miembros de los paneles de seroconversión, 2.773 muestras representan 126 muestras reactivas (prevalencia = 6.,8%) y se analizaron 2.647 muestras no reactivas. El DUO Ultra clasificó correctamente 2.757 (99,4%) de las muestras. Aunque todas las 126 muestras reactivas fueron clasificadas correctamente como reactivas por el DUO Ultra (100% de sensibilidad), 16 muestras fueron identificadas como reactivas solo por el DUO Ultra. Trece de estas muestras fueron analizadas por RT-PCR, pero no se pudieron demostrar niveles de ARN superiores a 50 copias/ml. Las tres muestras restantes se interpretaron como no concluyentes según los resultados del análisis de Western blot (indeterminado), ya que los volúmenes de estas muestras eran insuficientes para las pruebas de ARN., Dado que no se puede determinar el verdadero estado de estas tres muestras, fueron excluidas de los cálculos de especificidad. Por lo tanto, la sensibilidad epidemiológica del DUO Ultra fue del 100% (126 de 126), incluyendo una sensibilidad del 100% para las muestras de VIH-2, VIH-1 Grupo M clados y VIH-1 grupo O. La especificidad del DUO Ultra fue de al menos 99.5% (2,647 de 2,660) en general y 99.7% (1,010 de 1,013) en individuos de bajo riesgo en comparación con las pruebas autorizadas por la administración de alimentos y medicamentos.,

con respecto a las 16 muestras discordantes, los resultados del análisis de Western blot proporcionaron poca información adicional hacia la resolución. Como se señaló, 11 de las 16 muestras discordantes exhibieron reacciones casi exclusivamente a los componentes principales (p18, p24 y p55). Las reacciones a estos componentes no diferencian la infección temprana de las reacciones inespecíficas en individuos no infectados (2)., Esto también es cierto para las cinco muestras que produjeron resultados negativos, ya que está bien documentado por los paneles de seroconversión que los resultados de Western blot pueden ser negativos durante la infección temprana cuando las pruebas de detección son reactivas (2). Se presume que el DUO Ultra produjo resultados de falsa reactividad al menos en los 13 que se probaron para la presencia de ARN. Sin embargo, la infección temprana no se puede descartar ya que la integridad del procesamiento de la muestra no estaba bajo nuestro control y EDTA puede no haber sido utilizado para recoger la muestra de sangre como se recomienda para el análisis de PCR., Suponiendo que las muestras fueron procesadas apropiadamente, es probable que estos resultados representen resultados falsos positivos por parte del DUO Ultra, ya que no se detectó ARN en las muestras que podrían ser probadas y se habrían esperado niveles detectables de ARN durante la infección temprana. Además, si estas muestras hubieran sido de personas con infección establecida sometidas a terapia antiviral donde los niveles de ARN pueden haber sido indetectables, los perfiles de Western blot deberían haber sido más avanzados., La razón de estos resultados presumiblemente falsos positivos es incierta ya que el DUO Ultra incorpora gp36, gp41 y gp160. No hubo ninguna reactividad a los antígenos de la envoltura en el Western blot. También debe tenerse en cuenta que la tasa de positividad falsa del DUO Ultra (0,5%) debe compararse con la tasa de positividad falsa colectiva de las pruebas de anticuerpos y antígenos de referencia. Por lo tanto, la especificidad del DUO Ultra puede considerarse equivalente o mejor que la de los ensayos rutinarios de VIH que detectan anticuerpos y antígenos.,

Cuando el ensayo fue desafiado por su sensibilidad analítica, se utilizó un gran número de paneles de seroconversión y un panel de clados del grupo m del VIH-1 que tenían antígeno detectable. Estos paneles han sido bien caracterizados para la detección de anticuerpos y antígenos del VIH utilizando una variedad de pruebas disponibles comercialmente y son útiles para evaluar la capacidad de los ensayos para detectar la infección temprana (2). Como se señaló, el DUO Ultra produjo resultados equivalentes o mejores que los de las pruebas que se utilizaron para caracterizar los paneles de seroconversión., En promedio, el DUO Ultra detectó la infección 12,4 días antes que los ensayos de anticuerpos comerciales de referencia de tercera generación. En comparación con los ensayos de antígeno comerciales, el DUO Ultra detectó la infección el mismo día que uno o más de los ensayos de antígeno de referencia. En 2 de los 10 paneles, EL DUO Ultra detectó el antígeno p24 18 días (cuatro sangrados) y 5 días (un sangrado) antes que uno o más de los ensayos de antígeno de referencia., En solo un sangrado de 1 de los 10 paneles de seroconversión, el DUO Ultra fue menos sensible para la detección de antígenos (2 días después) que solo uno de los cinco ensayos de antígenos utilizados para caracterizar el panel. Además, el DUO Ultra correlacionó exactamente con el Abbott HIVAG-1 para la detección del antígeno en las muestras del clado m del grupo VIH-1. Esta alta sensibilidad analítica de detección por el DUO Ultra se atribuye muy probablemente a la combinación de un formato de tercera generación (sándwich de antígeno) para la detección de anticuerpos y la capacidad de detectar antígeno simultáneamente.,

hasta donde sabemos, existen actualmente ocho ensayos comerciales de cuarta generación para la detección de anticuerpos y antígenos. Además del DUO Ultra, está el Enzymun-Test HIV Combi (Boehringer Mannheim), Vironostika HIV Uni-Form II Ag/AB (Organon Teknika), AxSYM HIV Ag/AB (Abbott), Enzygnost HIV Integral (Dade Behring Marburg), Genescreen Plus HIV Ag-AB (Bio-Rad) y Cobas Core HIV Combi (Roche Diagnostics GmbH)., El octavo ensayo es un ensayo de combinación sándwich de doble antígeno de 18 minutos llamado Elecsys HIV Combi (Boehringer Mannheim) que se ha notificado que tiene una especificidad del 99,8% cuando se desafía con una cohorte de pacientes hospitalizados (F. Donie, B. Upmeier, E. Hoess, y E. Faatz, Abstr. 12th World AIDS Conf., abstr. 163/41102, 1998). Este ensayo rápido se basa en la electroquimioluminiscencia y se informa que reduce el período de ventana en 5 días. Un noveno ensayo no comercial, no identificado, es un ensayo inmunoenzimático lineal evaluado para tener una sensibilidad de solo 99,5% y una especificidad de 94.,8%, y una evaluación informó que el tiempo necesario para diagnosticar la infección aguda se redujo a aproximadamente 2 semanas (19).

estos ensayos han demostrado sensibilidades que van del 99,5 al 100%. Varios estudios con grandes tamaños de muestra han reportado sensibilidades de 98 a 99.,87% por la Vironostika HIV Uni-Form II Ag/AB, La Enzymun-Test HIV Combi, AxSYM HIV Ag/AB, y la Enzygnost HIV Integral (14, 23; Brust y Knapp, Abstr. XIII Int. AIDS Conf.; Faatz et al., Abstr. 12th World AIDS Conf.; and West et al., Abstr. XIII Int. AIDS Conf. Utilizando paneles de seroconversión, varias evaluaciones han calculado una reducción en la ventana diagnóstica en un mínimo de 4 días y algunas incluso han reportado una reducción de hasta 9 días utilizando los ensayos de cuarta generación (14, 24, 26)., Las especificidades han oscilado entre el 98 y el 100%, excluyendo un estudio que reportó una especificidad de solo el 88,2% (26). Este último estudio probó el desempeño del dúo VIH con un tamaño de muestra de solo 250 muestras potencialmente reactivas cruzadas, como muestras de mujeres embarazadas; pacientes con trastornos autoinmunes o factor reumatoide; pacientes reactivos para anticuerpos IgM al citomegalovirus, virus del herpes simple, virus de la rubéola o toxoplasmosis; y pacientes infectados con hepatitis C o virus de Epstein-Barr.,

de hecho, todos los estudios revisados que han evaluado el sistema bioMérieux se han realizado utilizando el HIV DUO (15, 18, 26, 27). Tres de los cuatro estudios han reportado sensibilidades del 100% al analizar muestras de individuos con infecciones tempranas y establecidas (15, 18, 27). El único estudio que reportó una sensibilidad del 91,4% utilizó 17 paneles de seroconversión y, por lo tanto, evaluó la sensibilidad analítica, no la sensibilidad epidemiológica (capacidad para detectar la infección establecida) (26). Además del estudio mencionado anteriormente, que reportó una especificidad de 88.,2%, otro estudio en el que se utilizó el dúo VIH demostró una especificidad que oscilaba entre el 98,2 y el 100% cuando se analizaron pequeñas cohortes de muestras potencialmente reactivas cruzadas (15, 26). El cuarto estudio reportó una especificidad del 99,5% en una evaluación multicéntrica muy grande utilizando muestras de 29.657 pacientes (18)., Además de detectar a los 453 individuos infectados por el VIH, el dúo de VIH tuvo la capacidad de detectar la infección temprana en 17 muestras que contenían antígeno p24 que no eran reactivos mediante los ensayos de referencia de tercera generación y mediante Western blot, apoyando aún más los beneficios de agregar el componente de prueba de antígeno a una prueba de detección. Curiosamente, solo 11 de las 17 muestras tenían niveles detectables de ARN, y las 17 se resolvieron como infecciones agudas en las pruebas de seguimiento (18).,

comparativamente, el presente estudio es el PRIMERO en evaluar la nueva versión, EL DUO Ultra, y utilizar la mayor variedad de muestras y poblaciones de muestras, incluyendo pacientes hospitalizados, pacientes ambulatorios, donantes de sangre, muestras de VIH-2, muestras de VIH-1 grupo O, clados de VIH-1 Grupo M, pacientes de tres ubicaciones geográficas y paneles de seroconversión. Desafiado con 2,647 muestras no reactivas de varios entornos y ubicaciones geográficas, la especificidad de al menos 99.,El 5% podría haber sido mayor, ya que 8 de los 13 resultados presumiblemente falsos positivos fueron indeterminados por el western bloting, impartiendo cierta incertidumbre con respecto a su verdadero estado. De hecho, la especificidad fue del 99,7% cuando se analizaron 1.010 muestras de donantes de sangre.

la antigenemia del VIH p24 ocurre temprano después de la infección; sin embargo, cuando los anticuerpos se vuelven detectables, el antígeno generalmente no es demostrable, muy probablemente debido a complejos antígeno-anticuerpo en la sangre, por lo tanto, es necesario una prueba para el anticuerpo del VIH también (6)., Aunque la presencia de antígeno es altamente específica para la infección, una limitación significativa de los ensayos puede ser niveles insensibles de detección, porque las concentraciones bajas de antígeno son difíciles de detectar y la antigenemia ocurre solo transitoriamente durante diferentes etapas de la infección (13). La prueba del antígeno puede ser incapaz de detectar el 75% de los individuos de bajo riesgo que están infectados pero son seronegativos (12).,

con el fin de garantizar aún más la seguridad del suministro de sangre, el análisis del antígeno p24, además de las pruebas de anticuerpos contra el VIH, se utiliza para examinar la sangre, los componentes sanguíneos, los leucocitos de origen y el plasma de origen destinado a la transfusión en los Estados Unidos (11). Antes de 1995, se estimaba que una donación de sangre de cada 210.000 a 1.140.000 en los Estados Unidos procedía de una persona infectada por el VIH durante el período de ventana, que suele ser de 22 a 25 días o más (17)., Mediante la realización de pruebas de detección de antígenos en la sangre, se calcula que cada año se pueden prevenir de cuatro a seis casos de infecciones por el VIH asociadas a transfusiones, lo que reduce el riesgo estimado por unidad transfundida a un rango de uno de cada 562.000 a uno de cada 825.000 (9, 17). Por lo tanto, parece que la prueba de antígeno tiene utilidad para ayudar a proteger el suministro de sangre, aunque a un costo superior a $60 millones anuales. Debido a su capacidad para detectar el antígeno p24, el DUO Ultra y otros Elisa de cuarta generación serán de valor en la detección temprana de la infección.,

basado en su rendimiento y configuración del DUO Ultra, el ensayo es altamente aplicable para el diagnóstico de infección por VIH temprana y establecida por hospitales y laboratorios clínicos privados y otros entornos de laboratorio. En estos entornos, las personas que deben ser examinadas para detectar la infección provienen de grupos de mayor riesgo que la población de donantes de sangre y, por lo tanto, requieren el uso de métodos de prueba con altos niveles de sensibilidad analítica para la infección primaria., Es significativo que el alto nivel de sensibilidad analítica y epidemiológica demostrado por el DUO Ultra con paneles de seroconversión y clade, así como con una variedad de poblaciones de pacientes, lo hace ideal para su uso en una variedad de situaciones de prueba para el diagnóstico de infección temprana y establecida.

Once muestras infectadas por el VIH fueron identificadas por el DUO Ultra a través de la detección de antígenos., En entornos de laboratorio rutinarios, estos individuos no habrían sido identificados por los análisis de anticuerpos de detección habituales, ya que la prueba de antígenos de los pacientes no se realiza comúnmente como una herramienta de detección fuera de los bancos de sangre (6). Se ha demostrado que la detección precoz de la infección es beneficiosa para el inicio inmediato del tratamiento antirretroviral adecuado en un periodo de tiempo clínicamente relevante. Además, la detección temprana ayudará en la implementación oportuna de intervenciones, como el asesoramiento de los pacientes, la prevención de la transmisión y el manejo de la infección.,

a través de la prueba simultánea de la presencia de antígeno y anticuerpo del VIH, el DUO Ultra no solo proporcionará una mayor iniciación y eficiencia del tratamiento y una reducción en el riesgo de transmisión, sino que ofrece varias ventajas sobre las pruebas convencionales de anticuerpos y antígenos. Disminuye el tiempo necesario para realizar pruebas de anticuerpos y antígenos en al menos un 50%, ya que el DUO Ultra completará ambas pruebas simultáneamente en un período comparable al necesario para realizar uno de los ensayos de forma independiente. El DUO Ultra es un sistema eficiente y automatizado; p. e. ,, después de introducir suero o plasma en el pozo de muestra de la tira de reactivo e ingresar la identificación en el programa de computadora, el instrumento funcionará de forma independiente para completar las pruebas de hasta 30 muestras en 2.5 h en ausencia de más tiempo práctico o supervisión. Por lo tanto, el tiempo práctico para el técnico es de aproximadamente 20 a 30 minutos por 30 pruebas para detectar tanto el antígeno como el anticuerpo., En tercer lugar, ofrece flexibilidad porque cualquier número de muestras (de 1 a 28 con dos controles) se pueden probar sin el desperdicio de reactivos o pozos de tiras y porque las muestras se pueden probar durante la noche sin monitoreo. Se pueden realizar fácilmente tres series de corridas por día, cada una de las cuales consta de 30 muestras para un total de 90 muestras por día. Aunque el fabricante no ha cotizado un precio, es razonable suponer que el precio del DUO Ultra será competitivo con el precio colectivo de las pruebas de anticuerpos y antígenos.,

los ensayos de VIH han evolucionado en la última década para producir pruebas que poseen características novedosas y que pueden abordar aquellos problemas diagnósticos que permanecen, por ejemplo, detección de infección temprana, resultados indeterminados, infección en el recién nacido, la necesidad de resultados rápidos, etc. La disponibilidad de una prueba de cuarta generación capaz de ofrecer un aumento en la sensibilidad sobre otras pruebas de anticuerpos es otro paso evolutivo., El concepto de detección simultánea de antígenos y anticuerpos es de gran importancia, ya que existe una clara necesidad de Continuar las pruebas de infección temprana y aplicar estrategias de ahorro de costos. Este estudio, junto con los estudios de otros, ha comprobado que este tipo de estrategia de pruebas es precisa y eficaz y ofrece una serie de ventajas sobre las generaciones anteriores de anticuerpos y antígenos ELISAs.