Desarrollo de ensayos: 5 consideraciones y 8 Fundamentos

la capacidad de diseñar, construir y ejecutar ensayos que sean específicos, sensibles y robustos es crucial en todas las áreas de la investigación biomédica. A modo de ejemplo, en aplicaciones de investigación básica uno puede necesitar cuantificar los niveles celulares de una proteína particular, determinar los niveles de un metabolito en suero o orina o, tal vez, comparar la actividad catalítica de una enzima en tejido normal y enfermo ., En las industrias farmacéutica y biotecnológica se requieren ensayos para la identificación y caracterización de nuevas moléculas de fármacos potenciales . Otros estudios pueden requerir la medición cuantitativa de los niveles de expresión génica .

independientemente de la aplicación específica o de la molécula particular a medir, una serie de factores fundamentales deben ser considerados al desarrollar un ensayo biológico., Es importante que se preste una atención cuidadosa no solo al ensayo en sí, sino también a todo el flujo de trabajo que debe desarrollarse desde la preparación de la muestra hasta el análisis de la calidad de los datos proporcionados por el ensayo. Los aspectos clave del desarrollo de ensayos discutidos en este artículo son de aplicabilidad general. Son válidos independientemente del tipo de ensayo a desarrollar (p. ej.,, ensayos basados en anticuerpos como ELISA y electroquimioluminiscencia, determinación de la concentración total de proteína / proteína, ensayos de actividad enzimática, ensayos basados en células o PCR cuantitativa, o ensayos especializados como el ensayo de activación de una sola molécula ). Del mismo modo, los aspectos clave son válidos independientemente del sistema de detección empleado, ya sea basado en absorbancia, fluorescencia, radiactividad o incluso espectrometría de masas., Cada ensayo específico tendrá su propia idiosincrasia, pero al prestar atención cuidadosa a los puntos discutidos a continuación, el investigador puede ayudar a garantizar que desarrollen un ensayo robusto, confiable y adecuado para su propósito. A menudo, existen directrices y/o extensas discusiones sobre el desarrollo de ensayos utilizando tecnologías específicas, como las de mediciones de péptidos específicos espectrometría de masas . Aunque se centra en las cuestiones particulares de los ensayos específicos de EM, varios de los puntos de debate son pertinentes para cualquier proyecto de desarrollo de ensayos., En particular, los autores subrayan la necesidad de adoptar un enfoque adecuado para el desarrollo y la validación de los ensayos . Los ensayos complejos basados en células que tienen como objetivo imitar el entorno celular in vivo están jugando un papel cada vez más importante en el descubrimiento y desarrollo de fármacos. Si bien los detalles específicos de tales ensayos están más allá del alcance de este artículo, es importante enfatizar que los principios básicos del desarrollo de ensayos deben cumplirse para construir ensayos robustos y confiables que generen datos significativos .,

Los kits de desarrollo de ensayos comerciales están disponibles para facilitar el establecimiento de ensayos. Por ejemplo, Stadtmauer EA et al utilizaron el kit de reactivo auxiliar DuoSet de R&D Systems para establecer un ensayo de ELISA que detecta la proteína Cas9 residual en células T diseñadas con CRISPR . Las organizaciones comerciales han desarrollado una amplia gama de ensayos, y primero deben explorarse antes de emprender el esfuerzo para desarrollar un nuevo ensayo. Los ensayos de muestra incluyen el MILLIPLEX MAP mouse angiogenesis magnetic bead-based assay de Milliporesiigma .,

al embarcarse en un proyecto de desarrollo de ensayos, el investigador debe hacer una serie de preguntas para definir los requisitos exactos del ensayo.

el punto de partida es ser absolutamente claro en cuanto a qué molécula y precisamente qué propiedad de esa molécula se va a medir. Esto puede sonar obvio, pero es una cuestión de importancia fundamental y sustenta todas las actividades posteriores de desarrollo de ensayos. Por ejemplo, ¿desea el investigador medir la cantidad total de una proteína en particular en un lisado celular o solo la forma fosforilada, o tanto la proteína total como la fosforilada ?, Del mismo modo, el estudio puede dictar que las isoformas específicas o variantes de empalme de la proteína de interés necesitan ser medidas . En el caso de una proteína, es necesario tener claro si el parámetro clave a medir es la cantidad de la proteína presente o su función biológica, como la actividad enzimática o el efecto de una citocina sobre posibles objetivos celulares. Alternativamente, puede ser aceptable o deseable medir el nivel de expresión génica a nivel de ARNm., Puede ser que el estudio dicte que se desarrollen ensayos separados para medir la expresión génica, los niveles de proteínas en estado estacionario y la función biológica, respectivamente; cada ensayo generará información diferente pero complementaria sobre la molécula de interés.

es importante considerar la fuente de la molécula que va a ser ensayada. ¿Se va a medir la molécula en un líquido corporal, como suero u orina? ¿Se va a medir la molécula en un órgano obtenido de un animal experimental, o una muestra de biopsia de un paciente?, Tal vez el material de origen sea tejido post-mortem. Puede ser que la fuente sean células cultivadas in vitro, en cuyo caso una consideración importante es si estas serán células primarias escasas o una línea celular inmortalizada fácilmente escalable.

la fuente de la molécula determinará la cantidad y disponibilidad de la muestra. También determinará la concentración de la molécula de interés y puede influir profundamente en su estabilidad, como se discute en las siguientes secciones., Por lo tanto, es probable que la fuente de la molécula de interés tenga una influencia significativa en el flujo de trabajo de ensayo general que se desarrolla en última instancia.

también es importante comprender la estabilidad de la molécula para la que se va a desarrollar el ensayo. ¿Es relativamente estable o extremadamente inestable, lo que requiere que se tomen precauciones especiales durante la recogida y preparación de la muestra para el ensayo a fin de obtener datos significativos?, Incluso las moléculas que son estables en la forma aislada pueden ser inestables en el medio biológico complejo de las muestras a analizar, donde pueden estar sujetas a oxidación, proteólisis o pérdida de modificaciones post-traduccionales. Por ejemplo, puede ser necesario incluir agentes reductores o inhibidores de proteasa y/o fosfatasa en tampones de muestras para mantener las moléculas en sus formas fisiológicamente relevantes tanto durante la preparación de la muestra como durante el propio ensayo., La fuente de la molécula es una consideración importante aquí; una molécula que es estable en, digamos, suero puede resultar extremadamente inestable en un homogeneizado hepático. Si se realiza una biopsia o tejido post mortem, es importante saber cómo se ha manipulado y almacenado el tejido, ya que esto puede afectar profundamente tanto la cantidad como la calidad de ciertas moléculas.,

para desarrollar un ensayo que sea adecuado para su propósito, es importante decidir desde el principio si una medición semicuantitativa de la molécula, como Western blot, cumple con los requisitos del proyecto o si se requiere un ensayo rigurosamente cuantitativo.

también es importante considerar cuántas muestras deberán analizarse. Si solo se analizaran un puñado de muestras, entonces un formato de ensayo manual de múltiples pasos, que requiere mucha mano de obra, podría ser perfectamente aceptable., Por el contrario, si se van a ejecutar miles o decenas de miles de ensayos, tal vez como parte de un ejercicio de perfilado compuesto, será importante simplificar, racionalizar y automatizar el proceso de ensayo tanto como lo permitan los recursos de laboratorio, con, por ejemplo, un formato como microarray. Sin embargo, los arreglos traen su propio conjunto de problemas, como la variación espacial intra-ensayo .,

las respuestas a todas estas preguntas relativas a la molécula a analizar jugarán un papel clave para ayudar al investigador a decidir el formato más adecuado para sus necesidades particulares, y deben tenerse en cuenta al considerar los fundamentos del ensayo discutidos en la siguiente sección.

después de haber considerado estas preguntas con respecto a la molécula a ensayar, se debe prestar especial atención a una serie de cuestiones técnicas/prácticas fundamentales que se aplican independientemente de la molécula particular de interés o el formato de ensayo específico adoptado.,

absolutamente Una consideración clave es la especificidad del ensayo. Habiendo decidido exactamente qué molécula y parámetro de esa molécula se va a medir, el investigador necesita establecer que el ensayo medirá solo lo que quiere que mida y no nada más., Si resulta que el ensayo está midiendo tanto la molécula deseada como otras moléculas, entonces es posible que se puedan tomar medidas para mejorar la especificidad del ensayo.

deben considerarse dos aspectos superpuestos de la especificidad del ensayo.

• En primer lugar, ¿son los reactivos de detección primarios adecuadamente específicos? Por ejemplo, en el caso del ensayo basado en HPLC, qué tan seguro está el investigador de que un pico identificado en un momento de retención particular es la molécula de interés y no una molécula diferente que simplemente sucede co-elute con la molécula de interés., Aquí se debe considerar la fuente del analito. El análisis de muestras de orina puede no dar lugar a picos Co-eluting con la molécula de interés. Sin embargo, puede que no ocurra lo mismo con las muestras de suero o de homogeneizado tisular analizadas en el mismo ensayo. En un ensayo basado en anticuerpos, ¿el anticuerpo empleado es absolutamente específico para la proteína diana o también reacciona de forma cruzada con otras proteínas?, Es posible obtener anticuerpos que son específicos para una proteína en particular o una modificación post-traslacional en particular, como la fosforilación en un sitio específico o a un Neo-epítopo generado tras la escisión por una proteinasa . Muy a menudo, se desea un anticuerpo con mayor afinidad . Estos reactivos de anticuerpos deben caracterizarse rigurosamente en las condiciones reales de ensayo para garantizar que tienen la especificidad deseada, reaccionando solo con el producto deseado y no con la molécula de sustrato / precursor., En ensayos que no usan detección de anticuerpos, como un ensayo de escisión de péptidos fluorogénicos, el grado de especificidad será mucho menor. En lugar de la escisión en un sitio específico que genera una señal, la escisión en cualquier sitio dentro del péptido ahora dará lugar a una señal.
• Esto nos lleva al segundo aspecto de la especificidad del ensayo y es un problema particular para los ensayos enzimáticos in vitro., Incluso si los reactivos de detección son específicos para un evento en particular que uno desea analizar, bien puede ser que en un Lisado de células crudas o homogeneizado de tejidos que múltiples enzimas son capaces de efectuar ese mismo evento (por ejemplo, fosforilación, escisión proteolítica u otra modificación post-traslacional). Este problema será aún mayor para el ejemplo de ensayo de escisión de péptido fluorogénico dado anteriormente., El problema de múltiples actividades superpuestas en LISADOS crudos a menudo se puede superar mediante la inclusión de un paso adicional de preparación de la muestra, como una inmunodepresión específica, con el fin de lograr la especificidad de ensayo deseada . Alternativamente, dependiendo de la naturaleza del estudio, la mejor solución puede ser ejecutar el ensayo de actividad utilizando una enzima altamente purificada (nativa o recombinante).

¿Qué tan sensible debe ser el ensayo? Esto se determinará tanto por los niveles de la molécula de interés en la muestra como por el volumen de muestra disponible., El punto importante es que el ensayo debe ser lo suficientemente sensible como para que el nivel de la molécula caiga dentro del rango dinámico del ensayo (véase más adelante). Esta es una consideración importante a la hora de decidir sobre el formato del ensayo y el sistema de detección. Si se requiere una gran sensibilidad, entonces una fluorescencia, en lugar de absorbancia, la lectura es más probable que dé la sensibilidad deseada. La sensibilidad también puede incrementarse mediante la amplificación enzimática de la señal original ., Estos sistemas de ensayo «acoplados» pueden ser extremadamente sensibles, pero también proporcionan una mayor oportunidad para que la muestra de ensayo interfiera con el ensayo (véase más adelante).

es importante para determinar el rango dinámico del ensayo. En otras palabras, el rango sobre el cual la lectura del ensayo es proporcional a la cantidad de molécula objetivo en la muestra que se analiza., En el caso de un ensayo para medir la concentración de una molécula, es importante que el ensayo (independientemente del formato adoptado) esté calibrado adecuadamente mediante la construcción de una curva de calibración adecuada, como el ejemplo hipotético de la Figura 1. Del mismo modo, en el caso de un ensayo enzimático, debe asegurarse de que el ensayo esté funcionando en un rango tal que se mida la velocidad inicial de la reacción y que la velocidad medida sea proporcional a la cantidad de enzima añadida al ensayo., Para mantenerse dentro del rango dinámico del ensayo, puede ser necesario diluir o concentrar algunas muestras. Esto puede ser un problema particular si la molécula de interés está presente en niveles muy diferentes en diferentes muestras. Si no se mantiene dentro del rango dinámico del ensayo, se generarán datos falsos. Los rangos dinámicos también deben probarse in vivo, si el ensayo se va a utilizar in vivo, por ejemplo, utilizando líneas celulares que expresan un objetivo de anticuerpos a diferentes niveles para el desarrollo de un ensayo de IHQ .,

Figura 1. Calibración del ensayo / rango dinámico.

al diseñar un ensayo, es importante considerar los factores que pueden interferir con la lectura del ensayo que conducen a resultados erróneos. La cuestión de la especificidad del ensayo se discute anteriormente. Aquí discutimos otros factores que pueden interferir con la lectura del ensayo.

en el caso de una lectura fluorescente, es importante asegurarse de que la muestra a analizar no apaga la lectura fluorescente., Esto puede ser un problema particular con los ensayos que utilizan lisados de células crudas o homogeneizados de tejidos. Del mismo modo, en los ensayos enzimáticos o celulares fluorogénicos utilizados con fines de cribado/perfilado de compuestos, el investigador debe asegurarse, en la medida de lo posible, de que los compuestos de ensayo no apaguen la lectura fluorescente. Tales compuestos exhibirían actividad inhibitoria potente aparente mientras que realmente no teniendo ningún efecto inhibitorio directo en su blanco previsto. Algunos compuestos pueden tener fluorescencia, dando así una falsa señal de ensayo., Dicha interferencia compuesta se puede reducir mediante el uso de reporteros fluorescentes que excitan y emiten a longitudes de onda más largas . Otro problema común es la interferencia de los componentes de la muestra, tales como agentes reductores o detergentes con algunos de los ensayos populares de proteínas.

en ensayos acoplados enzimáticamente (ya sean ensayos de actividad enzimática o de metabolitos) es esencial determinar que las enzimas de acoplamiento no midan inadvertidamente algún componente de la muestra que no sea la molécula de interés., Si dichos ensayos se utilizan para el cribado o la caracterización de compuestos, es importante asegurarse de que el ensayo esté configurado de manera que mida la inhibición de la enzima Diana y no de la enzima o enzimas de acoplamiento . Si se sospecha una interferencia significativa de los componentes de la muestra de ensayo, se deben considerar cuidadosamente pasos tales como precipitaciones (inmunológicas) o purificación parcial para eliminar dichos componentes . El punto clave es, no importa qué formato de ensayo se adopte, estar alerta a las posibles fuentes de interferencia y formas de eliminar o minimizar su impacto en el ensayo., No se debe suponer que un ensayo desarrollado para medir una molécula en un determinado tipo de tejido/célula/fluido biológico funcionará de manera aceptable cuando el ensayo se realice en muestras de una fuente diferente; el ensayo tendrá que ser re-validado para la nueva fuente de muestra.

para obtener datos fiables y utilizables, el ensayo debe ser robusto y reproducible. El ensayo debe ser sólido en el sentido de que no se vea afectado indebidamente por los cambios en la preparación y manipulación de las muestras., Del mismo modo, debe dar los mismos resultados independientemente del individuo que opere el ensayo. El ensayo debe ser altamente reproducible (también denominado precisión) de manera que el grado de variación sea lo más pequeño posible tanto en el análisis intra como en el Inter. En un solo ensayo, las réplicas tanto de una muestra estándar como de una muestra «real» deberían dar valores muy similares, respectivamente. Del mismo modo, debe haber poca variación diaria en los valores de ensayo obtenidos.,

si el ensayo es medir la cantidad absoluta (en lugar de relativa) de una molécula, entonces debe calibrarse (véase más arriba) contra un estándar aceptado para dar una cuantificación precisa. A veces, el flujo de trabajo de ensayo requiere un trabajo de muestra significativo (por ejemplo, concentración, eliminación de componentes de muestra que interfieren, etc.)..) para que la molécula de interés pueda medirse de forma fiable. En tales casos, es muy conveniente incluir un estándar interno para corregir las pérdidas de analitos en todo el flujo de trabajo del ensayo., Por ejemplo, en el caso de los ensayos de MS, el extracto a analizar puede estar «enriquecido» con una cantidad conocida de isótopo estable de la molécula de interés. Para un ensayo de HPLC, el patrón interno podría ser un compuesto relacionado estructuralmente con la molécula de interés y que de otro modo no está presente en la muestra de ensayo. El uso de una norma interna es particularmente importante si se requieren datos cuantitativos muy precisos y precisos .,

los niveles de robustez, reproducibilidad y precisión que son aceptables dependerán del propósito del ensayo y deben ser decididos por el investigador para su propio uso actual particular.

asumiendo una distribución gaussiana, dos resultados, cuya media difiere por > 2 desviaciones estándar (de) se consideran estadísticamente significativamente diferentes en el nivel de confianza del 95%., Dos resultados que difieren de manera similar por > 3 de se consideran estadísticamente significativamente diferentes en el nivel de confianza del 99,7%. Por lo tanto, cuanto mayor sea la reproducibilidad (precisión) del ensayo y, por lo tanto, menor sea la SD de las lecturas experimentales, más discriminante será el ensayo.

Figura 2. Medición del rendimiento del ensayo.

el rendimiento del ensayo puede analizarse de varias maneras diferentes., La relación señal-fondo o ventana de señal (S/B = señal media / fondo medio) y la relación señal-ruido (S/N = señal media-fondo medio / SD del fondo) se utilizan a menudo como medidas del rendimiento del ensayo. Sin embargo, estas proporciones no tienen debidamente en cuenta la variabilidad del ensayo. Se ha desarrollado una prueba estadística simple, el valor Z’, que proporciona una medida de la calidad del ensayo que tiene en cuenta tanto la ventana de señal como la variabilidad del ensayo . Cuanto más alto es el valor de Z ‘(Figura 2), más discriminante es el ensayo, con un ensayo perfecto que tiene una Z’ de 1., Para un ensayo de cribado de alto rendimiento, se considera generalmente aceptable un valor Z’ de > 0,5. Aunque la estadística Z ‘ se derivó originalmente para evaluar ensayos HTS, es una medida general de la calidad del ensayo y se puede aplicar a cualquier ensayo .

los ensayos de alto rendimiento utilizados en el descubrimiento de fármacos utilizan con frecuencia reporteros fluorescentes y luminiscentes para permitir que un gran número de ensayos se realicen de manera automatizada., Sin embargo, con el desarrollo de nuevas tecnologías, hay un creciente interés en el uso de ensayos celulares sin etiquetas que utilizan métodos de detección biofísicos . Una serie de instrumentos para ensayos sin etiqueta ya están disponibles comercialmente . Es importante destacar que los ensayos sin etiquetas evitan el potencial de artefactos causados por la presencia del sistema reporter. Por ejemplo, la molécula de reportero bioluminiscente comúnmente utilizada luciferina luciérna es en sí misma un agonista parcial de GPR35 , lo que potencialmente complica la interpretación de los datos compuestos/farmacológicos., Un beneficio adicional de los ensayos sin etiqueta es que permiten el cribado de compuestos contra niveles endógenos de receptores en células primarias y células madre relevantes para la enfermedad .

Las interacciones inesperadas reportero-compuesto también pueden ocurrir en ensayos bioquímicos (además de los problemas de enfriamiento y autofluorescencia discutidos anteriormente). Por ejemplo, una serie de compuestos que se ha demostrado que activan la actividad de la proteína deacetilasa de SIRT1 utilizando un sustrato peptídico marcado con TAMRA no tuvo actividad en ensayos enzimáticos utilizando una versión no etiquetada del mismo péptido o un sustrato proteico nativo de longitud completa., La activación observada con el sustrato marcado con TAMRA fue un artefacto debido a una interacción física directa de los compuestos con el fluoróforo de TAMRA .

Por lo tanto, al diseñar y validar ensayos para fines de cribado/perfilado de compuestos, es importante considerar el potencial de interacciones compuesto-reportero. Los beneficios potenciales de utilizar un ensayo sin etiqueta en algún momento de la cascada de cribado deben ser considerados seriamente.