7.25.5.4 de la difusión a la perfusión
Sin embargo, la capacidad de difusión limita la profundidad tisular máxima en parches cardíacos que se diseñan de acuerdo con cualquiera de los principios, y la desnutrición y la hipoxia pueden disminuir la viabilidad de las regiones centrales de un parche cardíaco en crecimiento.71,96,101 para modelos que usan densidades celulares iniciales más altas que resultan en un agregado multicelular compacto, múltiples autores han propuesto una profundidad tisular máxima de ~100-200 µm., En el caso más extremo, los cultivos multicapa de cardiomiocitos sin armazón que se producen mediante un método denominado ingeniería de láminas celulares pueden experimentar limitaciones de difusión a un espesor muy bajo del conjunto, lo que resulta en un espesor máximo incluso inferior a 100 µm.,101 sin embargo, es poco probable que un parche cardíaco desarrolle las fuerzas activas deseadas para un aumento in vivo de la función cardíaca, ni resistirá las fuerzas que se cargan periódicamente en las diversas regiones de la pared miocárdica in vivo, a menos que las actuales limitaciones dramáticas en las dimensiones del parche físico sean superadas por nuevas modificaciones a los enfoques de fabricación actuales, particularmente las limitaciones en cuanto al grosor del tejido., Con este fin, se puede lograr un mayor grosor del tejido en crecimiento mediante varios métodos, incluyendo (1) apuntar a una menor densidad celular en el parche final, (2) usar un andamio con poros promedio más grandes, (3) instalar un sistema de convección medio o incluso una verdadera perfusión a través de una red vascular, y (4) la adición de otros tipos de células, como las células endoteliales y las células intersticiales., Los conceptos de las categorías (1) y (2) pueden dar lugar a un tejido más grueso, pero se espera que los resultados funcionales se deterioren porque las características del armazón probablemente superen el impacto de las células inoculadas.
siguiendo el concepto (3), varios grupos han probado una serie de biorreactores con el fin de aumentar la calidad de los parches cardíacos diseñados in vitro. En los primeros ensayos, una convección media en las superficies externas del parche ya dio lugar a un mejor resultado.,71 la viabilidad celular, el contenido celular total y los marcadores de diferenciación cardíaca mejoraron y estos efectos pueden incluso ser mejorados por la instalación de una verdadera perfusión. Sin embargo, un patrón de perfusión verdaderamente fisiológico depende de una enorme capacidad capilar, y una densidad capilar tal como está presente in vivo puede no ser alcanzable in vitro debido a limitaciones técnicas asumibles. En particular, la distancia media de los vasos capilares en el tejido miocárdico nativo oscila en el orden de solo 15-20 µm.,102 sin embargo, lejos de este nivel ideal de perfusión, un solo vaso central en una construcción de cardiomiocitos 3D puede proporcionar la plataforma estructural para una mejora significativa en la viabilidad y función celular cuando el medio de cultivo se bombea a través de él.103 utilizando técnicas de imagen disruptivas, una correlación espacial de la viabilidad con el nivel de perfusión puede hacerse visible, lo que demuestra el sorprendente efecto beneficioso de modificaciones relativamente simples en un modelo in vitro., Huelga decir que, junto con e incluso más allá de la supervivencia pura de los cardiomiocitos, una amplia gama de parámetros funcionales dependen en gran medida de la perfusión tisular.104 por lo tanto, la extensión de un buque central a múltiples buques se ha intentado en varios estudios.105-107 un parche cardíaco que se basa en un material sintético poroso que contiene varios canales de penetración de andamios se ha sembrado con cardiomiocitos para dar como resultado una mejor distribución celular espacial y la preservación de los marcadores de cardiomiocitos Maduros., Sin embargo, a pesar de los cambios positivos aparentes en cuanto a la nutrición y el suministro de oxígeno en las regiones centrales de los parches cardíacos de 2 mm de espesor, una masa celular compacta de profundidad considerablemente mayor que 100 µm es difícil de lograr, incluso en el caso del uso de andamios canalizados.105 como siguiente paso lógico, se han evaluado estructuras más delicadas para determinar su idoneidad como sustitutos de una red vascular., Los conjuntos de ramificación y recolección de estructuras tubulares interconectadas con diámetros más pequeños creados en el rango de 60-120 µm han demostrado ser accesibles a las técnicas de reendotelización in vitro.108 Al parecer, el progreso tecnológico en curso empuja continuamente los límites para la miniaturización de componentes estructurales biocompatibles, como las redes vasculares y los patrones de ECM.,109 Los experimentos de andamios micropatternados no solo han ampliado nuestra comprensión de la interrelación de la morfología y la función, sino que también han abierto un nuevo camino para la manipulación in vitro y la generación de sustratos vivos multicelulares.108-112 sigue siendo especulativo si esta tendencia en la reducción de escala experimental se guiará por una transferencia continua de la tecnología involucrada a la práctica clínica. Desde el punto de vista clínico, en el caso de un parche cardiaco canalizado se pueden experimentar algunas limitaciones en la sustitución de una estructura portante de la función de barrera sanguínea (p. ej.,, pared septal entre dos cámaras ventriculares o la pared ventricular libre). Más desafiante, en el caso de un árbol vascular miniaturizado, una conexión de todos los canales a una sola red y la vinculación de esta red a la circulación sanguínea justifican nuevas estrategias novedosas antes de que estos constructos puedan ser evaluados in vivo en estudios a largo plazo. A pesar de estas preocupaciones, los principios convincentes que se destacan en estos experimentos han establecido nuevos estándares para la generación de un parche cardiaco bioartificial.,
otro enfoque que tiene como objetivo establecer la perfusión tisular funcional se basa en la preservación y empleo de una red de vasculatura nativa intacta después de la eliminación selectiva de los componentes celulares circundantes. Este método se ha desarrollado en las últimas dos décadas y se ha extendido entre diversas disciplinas como la descelularización.113 sin embargo, el campo de la ingeniería tisular miocárdica ha recibido poca atención, en comparación con trabajos científicos similares con un enfoque en otros tipos de tejidos o sistemas de órganos, p.ej.,, ingeniería de tejidos urológicos o ingeniería de tejidos de válvulas cardíacas.114-117 pero recientemente, la descelularización ha experimentado un renacimiento como una herramienta mágica para evitar los tremendos problemas que actualmente limitan los conceptos de ingeniería de tejidos blandos. Mediante la aplicación controlada de una serie de soluciones detergentes equilibradas, es posible una interrupción de las uniones célula–célula y célula–ECM con cambios aceptables en la ECM. Este principio se ha aplicado a muchos tejidos y fragmentos de órganos, incluyendo la vejiga urinaria, la submucosa del intestino delgado, el músculo esquelético, los vasos arteriales y las válvulas cardíacas.,118-121 en un estudio reciente, la perfusión de un corazón de roedor con soluciones detergentes resultó en un corazón descelularizado que, en consecuencia, sirvió como plantilla para la ingeniería de tejidos cardíacos. Por inyección multifocal de cardiomiocitos de rata neonatal, se puede lograr actividad contráctil macroscópica que contribuye a la generación de fuerza detectable., Este modelo preliminar de un corazón entero de ingeniería tisular se ha caracterizado a nivel histológico, biológico molecular y electrofisiológico y los Resultados in vitro aumentan el entusiasmo sobre el futuro de la ingeniería tisular cardíaca. Lo que es más importante, Este modelo ya comprende una red vascular de alta calidad en términos de distribución de vasos en todo el andamio (Fig. 2)., Además, una reducción suave y gradual del diámetro del vaso que conduce en el lado arterial desde la aorta con escala milimétrica hasta los capilares con escala micrométrica y que regresa en el lado venoso desde los capilares hasta la aurícula derecha son las principales ventajas del origen nativo del desarrollo de los andamios descelularizados.122 sin embargo, se debe dirigir la atención a mantener la permeabilidad de las estructuras capilares, ya que pueden ser obstruidas por escombros celulares durante el proceso de lavado a lo largo de la descelularización., Se puede realizar una evaluación práctica mediante perfusión del sistema coronario mediante inyección de colorante indicador en la raíz aórtica del corazón descelularizado (Fig. 3). Sin embargo, una evaluación cuantitativa de la permeabilidad de la microvasculatura es más desafiante y requiere una cantidad considerable de trabajo de investigación para establecer resultados válidos y reproducibles. También, una oclusión trombótica durante la posterior transluminal repoblación (por ejemplo,,, la aplicación de células endoteliales a través de la vasculatura coronaria) o durante la perfusión in vivo con sangre total debe ser prevenida, y estudios más detallados deben probar la reproducibilidad y eficacia de la perfusión mantenida en condiciones in vivo.123-125 sin embargo, la prueba de concepto está ahí122 y los datos de estudios relacionados sobre implantes cardiovasculares descelularizados sugieren la viabilidad de medidas antitrombóticas innatas a través de la modificación de los protocolos de descelularización., Con este fin, una MEC miocárdica descelularizada se encuentra entre los principales andamios candidatos para la creación de un parche cardíaco, ya que cumple con varios prerrequisitos generales: (I) biocompatibilidad, (II) estabilidad biomecánica, (iii) vascularización, y (iv) el potencial de interacción biológica y remodelación.116 estudios en curso demostrarán en última instancia el valor in vivo de este enfoque.
Fig. 2. Vista macroscópica de un corazón de rata descelularizado con detergente con macrovasculatura conservada., La aorta ascendente está marcada con asteriscos; las flechas indican la arteria descendente anterior izquierda (da). AI: Orejuela auricular izquierda; TEVD: tracto de salida del ventrículo derecho.
Fig. 3. Evaluación bruta de la permeabilidad de la macrovasculatura coronaria. La aorta ascendente (asterisco) se intuba con una cánula y se inyecta una solución de colorante para perfundir el sistema vascular coronario de manera anterógrada para demostrar la macrovasculatura coronaria conservada., La flecha indica la arteria descendente anterior izquierda (da).
de acuerdo con otras estrategias con el objetivo de superar las limitaciones de tamaño en la ingeniería de parches cardíacos, se promueve la formación in vitro de estructuras capilares por las células endoteliales y sus progenitores. Utilizando un armazón líquido y una mezcla de células cardiacas y endoteliales, diferentes grupos han observado una reorganización espontánea in vitro de ambos tipos de células principales.,Se han observado 23.126 estructuras tubulares derivadas de células endoteliales que pueden parecerse a estructuras primitivas de tipo capilar en andamios sintéticos y biológicos durante el cultivo in vitro. Aunque las respectivas estructuras representan entidades individuales en localización suelta y dispersa sin una continuidad uniforme, han sido consideradas como sustitutos de un preordenamiento vascular con la opción de finalizar la maduración en la aplicación in vivo.126 este último aspecto queda demostrado en los ensayos con un modelo de implantación cardiaca en roedores, 100 que se analizan más a fondo en la sección 7.25.,5.2. Pero independientemente de la posibilidad de una eventual conexión de estos capilares primitivos a la circulación sistémica, hay un creciente cuerpo de evidencia que apoya la hipótesis de que una amplia gama de efectos biológicos sobre los cardiomiocitos y las células intersticiales pueden ser desencadenados por la fracción de células endoteliales en un parche cardíaco en crecimiento. La adición de CE apoya el mantenimiento de un estado diferenciado, representa un factor prosurvival y aumenta el rendimiento funcional de los parches cardíacos.,23.127 sorprendentemente, aunque se han empleado diferentes materiales biológicos y sintéticos con microestructura variable, el efecto de esta estrategia en el resultado en términos de viabilidad celular optimizada y actividad contráctil fue comparativamente alto, lo que sugiere un papel protector independiente para los cocultivos de CE en un parche cardíaco.
